七十味珍珠丸對大鼠腦缺血再灌注損傷的抗凋亡作用

朱敏俠，劉曉麗，戎浩，李楊，李捷，賀學(xué)，盛業(yè)萌

七十味珍珠丸對大鼠腦缺血再灌注損傷的抗凋亡作用

朱敏俠△，劉曉麗，戎浩，李楊，李捷，賀學(xué)，盛業(yè)萌

目的觀察七十味珍珠丸（RNSP）對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及抗凋亡機(jī)制。方法采用大腦中動脈阻塞模型，實(shí)驗分組：假手術(shù)組、模型組、溶媒對照組和RNSP組。神經(jīng)功能缺失評分觀察大鼠神經(jīng)缺失體征，紅四氮唑染色測量腦組織梗死面積，及Western blot檢測海馬組織Bcl-2/Bax比值和caspase-3的蛋白表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠神經(jīng)缺失體征明顯，腦梗死面積明顯增加，Bcl-2/Bax比值減小，caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高。而與模型組比較，RNSP組大鼠神經(jīng)缺失體征明顯改善，腦梗死面積減少，Bcl-2/Bax比值增大，caspase-3蛋白表達(dá)明顯降低。結(jié)論RNSP對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，與其上調(diào)Bcl-2/Bax比值，減少caspase-3蛋白表達(dá)的抗凋亡作用有關(guān)。

腦缺血；再灌注損傷；細(xì)胞凋亡；大鼠，Sprague-Dawley；七十味珍珠丸

缺血性腦卒中是中老年人的常見病、多發(fā)病，和心臟病、惡性腫瘤構(gòu)成人類三大致死性疾病，具有高致死率和高致殘率的特點(diǎn)［1-2］。長期以來，眾多醫(yī)務(wù)工作者對腦卒中的預(yù)防、發(fā)病和預(yù)后康復(fù)進(jìn)行著專注而持久的研究，一些藥物也被廣泛地應(yīng)用于研究當(dāng)中。藏藥七十味珍珠丸的藏文譯音為然納桑培（Rannasangpei，RNSP），是藏醫(yī)最有代表性的名貴珍寶藏成藥之一，是藏醫(yī)臨床治療各種急慢性腦血管及神經(jīng)系統(tǒng)疾病最常用的藥物［3］。本研究擬觀察七十味珍珠丸對缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制中腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其抗凋亡機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗動物60只健康成年雄性Sprague Dawley大鼠，40～45日齡，SPF級，環(huán)境溫度20～23℃，濕度40%～80%，自由飲水飲食。體質(zhì)量（200±20）g，實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2009-0019，購自復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物科學(xué)部。

1.2藥物與試劑七十味珍珠丸（西藏自治區(qū)藏藥廠，國藥準(zhǔn)字Z54020062）。紅四氮唑（2，3，5-triphenyltet?razolium chloride，TTC，美國 Ameresco公司），兔抗大鼠B cell lymphoma/leukemia 2（Bcl-2）抗體和小鼠抗大鼠Bcl-2 associated X protein（Bax）抗體（1∶1 000；美國Santa Cruz公司），兔抗大鼠caspase-3抗體（1∶1 000；美國Cell Signaling Technology公司），小鼠抗大鼠β-actin抗體（1∶5 000）、HRP標(biāo)記抗兔抗體（1∶1 000）和HRP標(biāo)記抗小鼠抗體（1∶1 000；美國Millipore公司）。

1.3儀器大腦中動脈阻塞模型栓線-AAAA級（北京沙東生物技術(shù)有限公司），大鼠腦模具（深圳瑞沃德生命科技有限公司），免疫印跡法（Western blot）全套設(shè)備（美國Bio-Rad公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國GE公司），凝膠分析系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司）。

1.4方法

1.4.1動物預(yù)處理給藥按照隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為4組：假手術(shù)組、模型組、溶媒對照組和七十味珍珠丸藥物（RNSP）組。將七十味珍珠丸研磨成粉并用蒸餾水稀釋（終濃度100 g/L），RNSP組以RNSP 0.1 mL/kg灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d，溶媒對照組以蒸餾水灌胃，最后1次灌胃后1 h制作模型。

1.4.2局灶性腦缺血再灌注模型的制備6%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位，頸部剪毛，常規(guī)消毒皮膚后，參照Longa線栓法［4］并加以改進(jìn)制備大鼠右側(cè)MCAO模型：先分離頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈和翼腭動脈，結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)心端，近心端穿線打一松結(jié)，血管夾暫時夾閉頸內(nèi)動脈和翼腭動脈，在頸外動脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎線和近心端松結(jié)之間剪一小口將栓線插入頸總動脈，拉緊松結(jié)的線并將遠(yuǎn)心端剪斷，頸外動脈向頸總動脈方向拉直，經(jīng)頸內(nèi)動脈插入栓線，插入長度約18 mm（自頸總動脈分叉處算起），再灌注時拔出栓線并結(jié)扎頸外動脈斷端。本課題選用缺血40 min再灌注24 h的時間點(diǎn)。假手術(shù)組插入栓線0.5～1 mm，其余操作同模型組。

1.4.3神經(jīng)功能缺失評分采用雙盲法對各組動物進(jìn)行評分記錄，參照Longa評分法［4］，分五級，0～4分：0分，無神經(jīng)系統(tǒng)損害癥狀；1分，不能完全伸直對側(cè)前爪；2分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。評分錄入電腦并進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4.4腦梗死面積測量麻醉斷頭取腦，腦組織于-20℃冷凍約10 min后置于腦模具中，每2 mm冠狀位切下，連續(xù)取6片腦組織，用0.1 mol/L PBS新鮮配制的2%TTC溶液避光染色30 min，最后用4%多聚甲醛固定24 h，拍照，用Image Pro-plus 6.0（Media Cybernetics，Sliver Spring，MD，USA）圖像分析軟件測量腦梗死面積，并按如下公式計算：腦梗死面積=（切片中梗死面積/全腦面積）×100%。TTC是檢測細(xì)胞活性的常用試劑，可被存活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原生成紅色物質(zhì)Formazan，因此，未梗死組織被染為紅色，而梗死組織不著色，呈現(xiàn)白色。每只大鼠的第4張腦片的梗死面積納入統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4.5Western blot實(shí)驗取大鼠右側(cè)海馬組織稱質(zhì)量，加入裂解液勻漿提取上清，測量蛋白濃度，加入等體積2×load?ing buffer后煮沸5 min做變性處理，然后上樣跑電泳。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，以濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜置于封閉液中室溫孵育2 h后，加入一抗工作液，4℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3次后，加入HRP標(biāo)記的二抗工作液，室溫孵育2 h，TBST洗膜5 min×3次，ECL顯影液加于膜上反應(yīng)2 min，在凝膠成像系統(tǒng)中選擇合適的曝光時間進(jìn)行顯影，圖像輸入凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行分析并保存數(shù)據(jù)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法實(shí)驗所有數(shù)據(jù)均以SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用One-Way ANOVA分析，組間多重比較采用LSD（方差齊）或Dunnett T3（方差不齊），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠神經(jīng)功能缺失體征4組間大鼠神經(jīng)功能缺失評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=50.589，P＜0.01，n= 8）。假手術(shù)組沒有神經(jīng)功能缺失體征，模型組（2.38±0.18）大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分增高，神經(jīng)功能缺失體征明顯。與模型組比較，RNSP組（1.50±0.19）大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分降低（P＜0.05），而溶媒對照組（2.50±0.19）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2大鼠腦梗死面積4組間大鼠腦梗死面積差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=65.091，P＜0.01，n=7）。假手術(shù)組沒有梗死，與模型組（37.24±0.93）%比較，RNSP組腦梗死面積占（22.71±2.79）%，顯著降低（P＜0.01），而溶媒對照組腦梗死面積占（35.83±3.10）%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

2.3Bcl-2/Bax比值4組間Bcl-2/Bax比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.877，P＜0.01，n=5）。與假手術(shù)組（1.00±0.00）比較，模型組 Bcl-2/Bax比值（0.72± 0.06）減小，與模型組比，RNSP組該比值（1.02±0.06）增大（均P＜0.01），而溶媒對照組（0.68±0.07）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

2.4caspase-3表達(dá)4組間caspase-3表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.191，P＜0.01，n=5）。與假手術(shù)組（1.00±0.00）比較，模型組該蛋白表達(dá)（1.22±0.04）增多，與模型組比，RNSP組該蛋白表達(dá)（0.74±0.10）減少（均P＜0.05），而溶媒對照組（1.30±0.06）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

Fig.2　RNSP increased ratio of Bcl-2/Bax圖2　七十味珍珠丸增加Bcl-2/Bax比值

Fig.3　RNSP decreased protein expression of caspase-3圖3　七十味珍珠丸減少caspase-3蛋白表達(dá)

3　討論

缺血性腦卒中的發(fā)病原因在于腦的主要供血動脈狹窄或閉塞，疾病發(fā)展過程中或后期治療時局部閉塞的血管再通，從而發(fā)生腦缺血再灌注損傷。實(shí)驗研究中，MCAO模型是模擬缺血性腦卒中的常用動物模型，線栓法制作MCAO模型自1989年Longa報道后廣為所用，該模型具有操作簡單、損傷小、無需開顱的特點(diǎn)，經(jīng)過大量的實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)、紋狀體、海馬和丘腦等都是易損區(qū)［4-5］。鑒于海馬對于學(xué)習(xí)、記憶及腦功能的重要性，本課題采用線栓法制作MCAO模型來觀察七十味珍珠丸對缺血性腦卒中的保護(hù)作用及發(fā)病過程中海馬組織凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。

近年來研究表明，腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的重要方式［6］。細(xì)胞凋亡過程受到一系列相關(guān)基因的調(diào)節(jié)和控制，主要有Bcl-2家族、Fas、C-myc、p53和caspase家族等。目前在缺血/再灌注中研究較多的是Bcl-2家族成員，包括抗凋亡蛋白，如Bcl-2和Bcl-XL，和促凋亡蛋白，如Bad、Bid、Bik、Bax和Bak。它們的許多家族成員都位于線粒體外膜，它們調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的機(jī)制可能是與其調(diào)節(jié)線粒體膜上通透性轉(zhuǎn)換孔，改變線粒體膜的通透性有關(guān)。線粒體膜的通透性增加時，細(xì)胞色素C可釋放入胞漿，并與凋亡激活因子（Apaf）結(jié)合引起后者構(gòu)象改變，最后激活caspase-9，轉(zhuǎn)而激活caspase-3等一系列級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致凋亡的發(fā)生［7-8］。

抗凋亡蛋白Bcl-2分子質(zhì)量為25～26 ku，人類Bax蛋白分子質(zhì)量為21 ku，與Bcl-2的同源性為21%，故稱Bax為Bcl-2家族成員。Bax是該家族中研究比較深入的，也是最具有代表性的促凋亡蛋白。Bax可與Bcl-2形成異源二聚體或自身形成同源二聚體。當(dāng)Bax超表達(dá)時，自身形成同源二聚體，細(xì)胞對凋亡信號的反應(yīng)增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡增多，當(dāng)Bcl-2超表達(dá)時，它與Bax形成異源二聚體，凋亡被抑制，因此，Bcl-2和Bax的比值決定了細(xì)胞凋亡的敏感性［9-10］。本實(shí)驗中，與假手術(shù)組比，模型組Bcl-2/Bax比值減小，而七十味珍珠丸可增加Bcl-2/Bax比值。

Caspase家族是一類天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，凋亡的最后實(shí)施是通過caspase的激活而實(shí)現(xiàn)的，而caspase-3為該級聯(lián)反應(yīng)的下游關(guān)鍵因子，在各種啟動的凋亡程序中起最后樞紐作用［9-11］。在缺血性腦卒中模型中發(fā)現(xiàn)caspase-3明顯上調(diào)，且在腦缺血及腦缺氧-缺血損傷保護(hù)作用的研究中也發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理和藥物保護(hù)等措施可通過減少細(xì)胞色素C的釋放和caspase-3的激活來減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡［12-14］。本研究結(jié)果也表明，模型組海馬組織caspase-3表達(dá)較假手術(shù)組明顯增多，而七十味珍珠丸藥物組caspase-3蛋白表達(dá)減少。

七十味珍珠丸主要由佐太、天然珍珠、天然牛黃、羚羊角、麝香、藏紅花等七十余味名貴藏藥組成，該藥在臨床和實(shí)驗研究中受到廣泛關(guān)注。在臨床應(yīng)用方面主要是治療卒中偏癱、阿爾茨海默病、高血壓、癲、腦震蕩、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、植物神經(jīng)功能紊亂和腦出血等［15-19］。在實(shí)驗研究方面主要用于鎮(zhèn)靜［20］、抗驚厥［21］、改善學(xué)習(xí)記憶［22］、改善微循環(huán)血流［23］、抗血栓形成［24］、急性腎性高血壓中的降壓［25］和腦血管疾病防治［23-24］等方面。腦缺血研究方面顯示：七十味珍珠丸對腦缺血疾病有類似阿司匹林的抗血栓作用，且效果強(qiáng)于阿司匹林，對大腦動脈血栓引起的局部缺血所致的行為障礙有改善作用，減少了腦梗死面積以及腦組織的病理學(xué)改變，說明該藥對腦缺血有保護(hù)作用［24］。通過本研究進(jìn)一步表明七十味珍珠丸可減少神經(jīng)缺失體征和腦梗死面積，對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，該作用與其抗凋亡機(jī)制相關(guān)，為臨床上七十味珍珠丸預(yù)防和治療缺血性腦卒中提供了更堅實(shí)的理論依據(jù)。

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（2014-06-18收稿2014-10-28修回）

（本文編輯魏杰）

Anti-apoptosis effect of Rannasangpei on brain ischemia and reperfusion injury in rats

ZHU Minxia△，LIU Xiaoli，RONG Hao，LI Yang，LI Jie，HE Xue，SHENG Yemeng
Medical College of Tibet University for Nationalities，Xianyang，Shaanxi 712082，China

ObjectiveTo observe the protective and anti-apoptosis effects of Rannasangpei（RNSP）on brain ischemia and reperfusion injury in rats.MethodsMiddle cerebral artery occlusion（MCAO）model was established and the groups were divided as sham group，MCAO group，vehicle+MCAO group and RNSP+MCAO group.Neuronal deficient signs，brain infarct area，the ratio of Bcl-2/Bax and the expression of caspase-3 were evaluated by neuronal deficient score，TTC （2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride）staining and Western blot respectively.ResultsCompared with those parameters in sham group，the neuronal deficient signs，infarct area and caspase-3 expression increased evidently while the ratio of Bcl-2/ Bax decreased markedly in MCAO group.But in RNSP+MCAO group，the neuronal deficient signs，infarct area and cas?pase-3 expression decreased greatly while the ratio of Bcl-2/Bax increased markedly compared with those parameters in MCAO group.ConclusionRNSP may have protective effects on brain ischemia and reperfusion，which is related to its an?ti-apoptosis role indicated by upregulation of Bcl-2/Bax ratios and downregulation of caspase-3.

brain ischemia；reperfusion injury；apoptosis；rats，Sprague-Dawley；Rannasangpei

R285.5

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.010

西藏自治區(qū)科技廳2010年第二批重點(diǎn)科研項目（藏科發(fā)［2010］154號）；西藏民族學(xué)院院級科研項目（10myY07）

陜西咸陽，西藏民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院（郵編712082）

朱敏俠（1982），女，講師，博士，主要從事腦缺血再灌注損傷研究

△E-mail：zhuminxia2001@163.com