羅格列酮對UVB誘導(dǎo)的小鼠光老化皮膚成纖維細(xì)胞MMPs表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成的影響

陳 亮， 畢 波， 曾繼平， 劉天一， 朱寧文， 楊清建， 賈傳龍， 盧勇舟， 周軼群， 楊 平

實(shí)驗(yàn)研究

羅格列酮對UVB誘導(dǎo)的小鼠光老化皮膚成纖維細(xì)胞MMPs表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白合成的影響

陳 亮， 畢 波， 曾繼平， 劉天一， 朱寧文， 楊清建， 賈傳龍， 盧勇舟， 周軼群， 楊 平

目的 探討羅格列酮(RO)對光老化皮膚成纖維細(xì)胞(FBs)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白合成的影響。方法 采用cck-8法檢測RO對FBs活性的影響。UVB反復(fù)照射誘導(dǎo)產(chǎn)生體外細(xì)胞光老化模型。造模結(jié)束24 h，Real-Time PCR檢測MMPs的表達(dá)。造模結(jié)束48 h，western blotting檢測彈性蛋白原和Ⅰ型膠原的表達(dá)。結(jié)果 低劑量RO對FBs的細(xì)胞活性無影響。UVB誘導(dǎo)的光老化FBs中，MMP-1，2，3，7和9的表達(dá)均顯著升高。40 μM RO能降低UVB引起的MMPs過表達(dá)(P<0.05)；同時(shí)，能在蛋白水平上減緩UVB對FBs彈性蛋白原和Ⅰ型膠原合成的抑制(P<0.05)。 結(jié)論RO可降低光老化FBs中MMPs的表達(dá)，增加彈性蛋白原和Ⅰ型膠原的合成，維持光老化皮膚ECM成分的穩(wěn)定，可作為對抗光老化的新手段。

羅格列酮; 光老化; 成纖維細(xì)胞;MMPs;ECM

紫外線等外源性因素引起的光老化在真皮表現(xiàn)為膠原降解增多，彈力纖維變性，從而導(dǎo)致皺紋產(chǎn)生和皮膚彈性減小[1]。這與皮膚成纖維細(xì)胞(fibroblasts, FBs)受UVB損害所導(dǎo)致的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)分泌增加，Ⅰ型膠原和彈性蛋白原合成減少密切相關(guān)[2-3]。近期許多研究指出，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ , PPAR-γ)作為細(xì)胞核激素受體家族中的配體激活受體成員，能參與調(diào)控炎癥反應(yīng)，抑制如MMPs、NF-kB和AP-1等相關(guān)炎癥因子的表達(dá)[4]。此外，還能干預(yù)氧化應(yīng)激反應(yīng)，在體內(nèi)外的細(xì)胞衰老進(jìn)程中起調(diào)節(jié)作用[5-6]。自2014年2～7月，我們利用此前構(gòu)建的體外FBs光老化模型(stress-induced premature senescence, SIPS)[7]，使用已知的PPAR-γ特異性高效激動(dòng)劑羅格列酮(Rosiglitazone, RO)，對光老化FBs的MMPs表達(dá)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)蛋白合成的影響進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 小鼠皮膚FBs的獲取 取1～3 d SPF級C57 BL/6小鼠，乙醚麻醉處死后，浸泡于75%乙醇中約10 min，用DMEM洗去殘留乙醇，置于培養(yǎng)皿中；剪刀分離背部皮膚，剪下皮膚組織塊約1 cm×1 cm，立即置于2%中性蛋白酶中，37 ℃恒溫消化4 h；將皮膚取出，鑷子分離表皮和真皮，將真皮剪碎后，置于0.1%膠原酶中，37 ℃恒溫?fù)u床消化2 h，至組織塊基本消失。1500 r/min離心5 min，收集沉淀；棄上清，細(xì)胞以DMEM+10% FBS制成細(xì)胞懸液，吹打均勻后以約2×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，于37 ℃、5% CO2、100%飽和濕度的條件下培養(yǎng)；接近80%融合時(shí)進(jìn)行傳代，比例約為1∶4。

1.2 藥物處理及光老化模型的建立 選用P2代細(xì)胞，使用含不同濃度RO的DMEM+10% FBS處理48 h。cck-8檢測細(xì)胞活性，選取合適濃度。將細(xì)胞隨機(jī)分成4組：正常組(不經(jīng)RO預(yù)處理，不經(jīng)UVB照射)，RO組(RO預(yù)處理，不經(jīng)UVB照射)，UVB模型組(不經(jīng)RO預(yù)處理，UVB照射)，UVB+RO組(RO預(yù)處理，UVB照射)。然后，采用此前本研究小組確立的方法，移去培養(yǎng)液，覆蓋薄層磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)，打開蓋子，置于UVB燈管(Philips TL 20 w/01 RS lamp)正下方，進(jìn)行首次照射，照射劑量(使用Lutron UV light meter測量)為120 mJ/cm2。照射完畢后，吸去PBS，加入10.0 ml DMEM+1% FBS繼續(xù)培養(yǎng)，每隔12 h照射1次，120 s/次，共4次；末次照射完成后改為DMEM+10%FBS培養(yǎng)。

1.3 Real-time PCR 檢測mRNA含量 末次照射24 h后，移除培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，加入1.0 ml Trizol(美國INVITROGEN 公司)，反復(fù)吹打數(shù)次，移至1.5 ml EP管中，加入氯仿400 μl，劇烈震蕩30 s，冰上靜置15 min，12000 r/min，4 ℃離心10 min。棄上清，加入75%乙醇洗滌，7500 r/min，4 ℃離心5 min。用40 μl DEPC水溶解RNA并用紫外分光光度計(jì)測定濃度。按每管2 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(TAKARA)，反應(yīng)體系為Buffer 4 μl，dNTP 1 μl，Oligo 1 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，酶抑制劑1 μl，RNA及H2O共12 μl。30 ℃10 min，42 ℃60 min，4 ℃保存。Real-time PCR體系為mix 10 μl，上游及下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，DEPC水7 μl。引物序列見表1。反應(yīng)條件為熱啟動(dòng)95 ℃10 min，隨后95 ℃ 30 s，60 ℃30 s，72 ℃45 s，共40循環(huán)，儀器為StrataGene Mx3000 p(美國AGILENT TECHNOLOGIES公司)。

表1 引物序列

1.4 Western blotting檢測蛋白表達(dá) 正常細(xì)胞或SIPS細(xì)胞末次照射48 h后，移去培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS洗滌3次，培養(yǎng)皿移至冰上，加入蛋白裂解液500 μl，用1.0 ml針頭反復(fù)吹打，轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，冰上靜置15 min。12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清，用BCA法測定蛋白濃度，取各個(gè)處理組蛋白提取液，調(diào)整蛋白濃度，與等體積2X上樣緩沖液混合，煮沸并離心，電泳分離蛋白并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，孵育袋中加入TEST稀釋的collagenⅠ、tropoelastin( abcam 1∶500)和GAPDH( boster 1∶2000)，4 ℃孵育過夜。采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(Jack-son 1∶ 2000)室溫孵育2 h。ECL化學(xué)發(fā)光法顯影和定影。

2 結(jié)果

2.1 RO對小鼠FBs活力的影響 為選擇適合的RO濃度處理細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)檢測，我們分別使用含有不同濃度RO的DMEM+10% FBS處理小鼠FBs，發(fā)現(xiàn)在足夠長的處理時(shí)間內(nèi)，較低濃度的(0～40 μM)RO對FBs的活性不產(chǎn)生影響，而較高濃度(80 μM)的RO會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性(圖 1)，對細(xì)胞的增殖產(chǎn)生不利影響。因此，我們選擇40 μM RO作為后續(xù)細(xì)胞處理的藥物濃度。

2.2 RO可降低光老化FBs中MMPs的過表達(dá) 大量的研究證明，紫外線照射誘導(dǎo)皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生MMPs增多，主要包括MMP-1，-2，-3，-7，-9。為了檢測RO對光老化FBs MMPs分泌的影響，40 μM RO處理后，體外建立光老化FBs模型，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。Real-time PCR檢測顯示，UVB模型組與正常組相比，MMP-1，2，3，7，9的表達(dá)分別增加11.3，3.1，8.9，3.3和5.0倍。而UVB+RO組與UVB模型組相比，除MMP-2之外，MMP-1，3，7，9的表達(dá)分別降低62.7%，60.4%，55.2%和36.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3RO可增加光老化FBs中彈性蛋白原和Ⅰ型膠原的合成 Ⅰ型膠原的銳減和彈性蛋白的崩解是光老化皮膚皺紋產(chǎn)生和彈性喪失的主要原因[8-9]。為了檢測RO對光老化FBs彈性蛋白原和Ⅰ型膠原合成的影響，40μMRO處理后，體外建立光老化FBs模型，繼續(xù)培養(yǎng)48h，Westernblotting檢測結(jié)果顯示，UVB模型組與正常組相比，彈性蛋白原和Ⅰ型膠原表達(dá)明顯下降，分別為正常細(xì)胞的25.2%和44.6%。而RO可以緩解UVB對FBs彈性蛋白原和Ⅰ型膠原合成的抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2，P<0.05)。

3 討論

紫外線是引起皮膚外源性老化的重要環(huán)境因素，紫外線照射可以導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞皮膚真皮局部的結(jié)締組織，使皮膚出現(xiàn)松弛、粗糙、色素沉積、彈性下降和皺紋增多等衰老表現(xiàn)[1]。FBs是皮膚真皮的主體細(xì)胞，己有大量研究證實(shí)，紫外線照射會(huì)誘導(dǎo)FBs產(chǎn)生MMPs增多(PK Vayalil, 2004年)并伴有ECM相關(guān)蛋白分泌減少[10-11]，這在皮膚光老化中起著重要作用[12]。隨著生態(tài)環(huán)境的惡化，皮膚光老化現(xiàn)象愈來愈嚴(yán)重，影響著人們的身心健康，而相應(yīng)的治療措施也多種多樣,但臨床上被廣泛接受的有效防止光老化的手段并不多，因此有關(guān)光老化發(fā)生的機(jī)制和防治成為目前的研究熱點(diǎn)。

PPAR-γ屬于配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，可通過激活各種組織細(xì)胞中一系列基因表達(dá)，增加葡萄糖氧化，增加葡萄糖和脂質(zhì)吸收，減少游離脂肪酸濃度，降低胰島素抵抗[4]。作為具有強(qiáng)烈PPAR-γ激動(dòng)活性的RO，臨床上已廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療。近期研究表明，PPAR-γ除了可調(diào)節(jié)糖脂代謝，降低胰島素抵抗外，還可以通過改善氧化應(yīng)激損傷，調(diào)節(jié)慢性炎癥反應(yīng)來參與生物體內(nèi)老化[13]，以及體外細(xì)胞的老化過程[5,14]。因此，本研究我們探討是否PPAR-γ的特異性強(qiáng)效激動(dòng)劑RO，同樣可以改善光老化FBs，對光老化FBs的分泌功能產(chǎn)生影響。

圖1 羅格列酮(RO)對小鼠成纖維細(xì)胞(FBs)活性的影響 a-e.不同濃度(0～80 μM)RO處理FBs 72 h后細(xì)胞生長情況 f.cck-8檢測不同濃度(0～80 μM)處理FBs 72 h后細(xì)胞的活性 圖2 RO對UVB誘導(dǎo)的光老化小鼠FBs彈性蛋白原和Ⅰ型膠原表達(dá)的影響 a. Western blot 檢測各組彈性蛋白原的表達(dá) b. Western blot 檢測各組Ⅰ型膠原的表達(dá)

Fig 1 Effects of RO on metabolism of MDFs. a-e. cell growth of FBs at 72 h after RO (0～80 μM) treatment. f. to evaluate the proliferative cell activity of FBs detected by cck8 test at 72 h after RO (0～80 μM) treatment. Fig 2 Effects of RO on expressions of tropoelastin and collagen-Ⅰ in FBs induced by UVB. a. expression of tropoelastin in each group by western blot. b. expression of collagen-Ⅰ in each group by western blot.

在光老化的發(fā)生機(jī)制中，一方面紫外線照射可通過激活細(xì)胞表面的表皮生長因子受體、細(xì)胞因子受體和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)反應(yīng)來上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子AP-1的表達(dá)，從而使MMPs的表達(dá)增加[8,15]。MMPs作為一組鋅離子依賴的蛋白水解酶類，又可通過水解、破壞及重組ECM，導(dǎo)致皮膚結(jié)締組織結(jié)構(gòu)重建，最終引起皮膚光老化的多種臨床表現(xiàn)(JH Chung, 2001年)?，F(xiàn)已知的在紫外線誘導(dǎo)所引起的皮膚光老化過程中起決定性作用的MMPs，主要包括降解Ⅰ型、Ⅲ型膠原的MMP-1(膠原酶), MMP-2 (明膠酶A), MMP-7 和MMP-9 (明膠酶B) 以及降解基底膜中Ⅳ型膠原的MMP-3 (基質(zhì)溶解素)[2,16]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RO能明顯減少紫外線誘導(dǎo)的光老化FBs中MMP-1，3，7，9的表達(dá)，這可能與PPAR-γ干擾NF-κB的激活以及下調(diào)p38 MAPK的磷酸化，從而使轉(zhuǎn)錄因子AP-1的生成減少有關(guān)[17]。另一方面，紫外線還可抑制多種ECM相關(guān)蛋白的合成，其中Ⅰ型膠原和彈性蛋白的減少，是導(dǎo)致各種光老化臨床表現(xiàn)的主要原因[8-9]。Ⅰ型膠原是ECM中最主要的填充物質(zhì)，占細(xì)胞外基質(zhì)成分的85%～90%，為皮膚提供飽滿的外觀(JH Chung, 1997年)。而彈性蛋白主要由彈性蛋白原(tropoelastin)及相關(guān)骨架小分子交聯(lián)形成，所形成的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)可使ECM具備一定的彈性和伸展性。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，UVB作用后，F(xiàn)Bs合成ECM相關(guān)蛋白的能力急劇下降，Ⅰ型膠原和彈性蛋白原分別下降至正常細(xì)胞的25.2%和44.6%，而RO的處理能明顯緩解UVB導(dǎo)致的Ⅰ型膠原和彈性蛋白原的合成抑制，起到改善光老化皮膚FBs分泌功能的效果。

我們通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RO可降低UVB誘導(dǎo)的光老化FBs中多種MMPs的表達(dá)，使皮膚ECM的分解減少；同時(shí)可以增加彈性蛋白原和Ⅰ型膠原的合成，從而延緩皮膚FBs光老化進(jìn)程，為皮膚光老化的治療提出了一種新的可能。然而，RO對光老化FBs的其他方面，比如細(xì)胞增殖和周期等又會(huì)有何影響，其發(fā)揮作用的具體機(jī)制是什么，是單純與PPAR-γ對NF-κB的干擾和p38 MAPK磷酸化的下調(diào)有關(guān)，還是主要通過其他途徑產(chǎn)生作用，將成為我們接下來的研究工作重點(diǎn)。

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Effects of rosiglitazone on the MMPs and ECM in UVB induced photo-aging mouse fibroblasts

CHENLiang,BIBo,ZENGJi-ping,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,HuadongHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai200040,China)

Objective To investigate the influence of Rosiglitazone (RO) on the expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and the synthesis of dermal extracellular matrix (ECM) proteins in photo-aging fibroblasts (FBs) induced by UVB. Methods The influence of RO on FBs proliferation was measured by cck 8 assay. The photo-aging model of FBs was induced by repeated UVB radiation. The influence of RO on the expression of MMPs of photo-aging mice FBs was evaluated by Real-Time PCR at 24 h after the last radiation and the synthesis of collagen I and tropoelastin were detected by western blotting at 48 h after the last radiation. Results No modification in the proliferative activity of FBs was observed at any dose tested up to 80 μM after 48 h. The UVB increased the expressions of MMP-1, 2, 3, 7 and 9 of FBs. But RO pretreatment inhibited the increasing expression of MMPs compared with the UVB group and the synthesis of tropoelastin and collagen I were increased by RO pretreatment in UVB+RO group compared with UVB group. Conclusion RO can maintain the metabolic balance of dermal ECM by decreasing the expression of MMPs and increasing the synthesis of tropoelastin and collagen I in photo-aging FBs. The novel application of RO may lead to innovative and effective anti-photoaging therapies.

Rosiglitazone; Photo-aging; Fibroblast; MMPs; ECM

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81272125；81301642)；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀學(xué)科帶頭人培養(yǎng)計(jì)劃資助項(xiàng)目(XBR2011033)；863基金資助項(xiàng)目(SS2014AA020705) 作者單位：200040 上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院 整形外科(陳 亮，畢 波，曾繼平，劉天一，楊清建，賈傳龍，盧勇舟，周軼群，楊 平)；復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 皮膚科(朱寧文)

陳 亮(1988-)，男，山東淄博人，碩士研究生. 通信作者：劉天一，200040，復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院 整形外科，電子信箱：tianyiliucn@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.08.017

R

A

1673-7040(2015)08-0500-04

2015-03-21)