葡聚糖-聚丙烯酸熒光納米凝膠用于皮膚淋巴管顯影的研究

王海珍， 戴婷婷， 崔春曉， 周淑彥， 蔣朝華， 竇紅靜

葡聚糖-聚丙烯酸熒光納米凝膠用于皮膚淋巴管顯影的研究

王海珍， 戴婷婷， 崔春曉， 周淑彥， 蔣朝華， 竇紅靜

目的 探討葡聚糖-聚丙烯酸熒光納米凝膠用于皮膚微淋巴管顯影的可行性和生物安全性。方法 應(yīng)用葡聚糖和聚丙烯酸為原料，合成熒光納米凝膠，采用掃描電鏡和納米粒度電位分析儀測(cè)定其表征。注入小鼠趾蹼皮下，在熒光顯微鏡下觀查小鼠下肢皮膚淋巴管走行和分布。1個(gè)月后，取其肝臟、腎臟、脾臟及心臟，進(jìn)行HE染色病理組織學(xué)檢查，驗(yàn)證其是否具有生物安全性。結(jié)果 葡聚糖和聚丙烯酸通過自組裝一步法合成了熒光納米凝膠，控制其粒徑約為180 nm，皮下注射能夠被皮膚淋巴管吸收，并清晰準(zhǔn)確地顯示和定位皮膚淋巴管，示蹤出皮膚淋巴管的走行和分布。組織學(xué)分析證實(shí)，遠(yuǎn)期未發(fā)現(xiàn)重要組織器官的病損。結(jié)論 葡聚糖-聚丙烯酸熒光納米凝膠能夠應(yīng)用于皮膚淋巴管的顯影，可以清晰地示蹤皮膚淋巴管的走行和分布，并具有生物安全性。

熒光納米凝膠； 淋巴管； 淋巴造影； 生物安全性

皮膚淋巴管參與了眾多疾病的病理過程，對(duì)皮膚淋巴管的研究有助于闡明其在淋巴管相關(guān)疾病病理過程中的作用機(jī)制[1]。因此，通過示蹤皮膚淋巴管來研究皮膚淋巴管的走行和分布特征具有十分重要的臨床意義。選擇合適的造影劑是皮膚淋巴管成像的關(guān)鍵[2]。近年來，熒光納米凝膠由于其生物親和性良好，粒徑適中而開始應(yīng)用于生物顯影[3-4]。葡聚糖-聚丙烯酸熒光納米凝膠(fluorescent dextran-based nanogels， FDNG)是由葡聚糖和聚丙烯酸按照一步法自組裝的方式合成的大分子熒光納米凝膠[3,5]。這種大分子凝膠因其合適的粒徑，高熒光強(qiáng)度和生物親和性，已成功用于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的示蹤顯影[6]和前哨淋巴結(jié)的示蹤，但能否應(yīng)用于皮膚淋巴管顯影，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。筆者通過用FDNG注射小鼠趾蹼皮下研究小鼠下肢皮膚淋巴管的走行分布，探討其應(yīng)用于皮膚淋巴管顯影的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 C57小鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；葡聚糖(dextran，分子量40 000)分析純(analytical reagent, AR)、丙烯酸(acrylic acid，AA)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水硫酸鎂(干燥過夜經(jīng)減壓蒸餾提純后使用)；5-氨基熒光素(Fluoresceinamine，isomer Ⅰ， 5-AF)，美國(guó)SIGMA公司；10%水合氯醛,深圳市騰龍?jiān)磳?shí)業(yè)有限公司；倒置相差顯微鏡(TS-100型)、熒光顯微鏡,日本OLYMPUS公司；數(shù)碼照相機(jī)(DXM-1200),日本NIKON公司。

1.2 葡聚糖-聚丙烯熒光納米凝膠的制備 FDNG由葡聚糖-聚丙烯納米凝膠(dextran-based nanogels，DNG)與熒光介質(zhì)5-AF采用自組裝一步法合成(由上海交通大學(xué)材料學(xué)院提供)。具體合成方法如下：取25 ml葡萄糖的儲(chǔ)備液，用注射器加入一定量的引發(fā)劑硝酸鈰銨，5 min后用微量進(jìn)樣器加入反應(yīng)單體丙烯酸，30 min后再加入交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酸酰胺；反應(yīng)結(jié)束后，制備得到DNG；再通過酰胺縮合反應(yīng)將帶有氨基的5-AF偶聯(lián)到DNG上，從而得到FDNG[3,5,7]，見圖1。

1.3 材料的表征 ⑴FDNG的形態(tài)觀察。納米凝膠經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后，通過透射電子顯微鏡觀察形態(tài)。將1 mg/ml納米凝膠的水溶液滴加在附有碳膜的銅網(wǎng)上，干燥后，用2%的磷鎢酸溶液(pH 6.0)染色2 h，用濾紙吸去染液，透射電子顯微鏡觀察。⑵FDNG粒徑的測(cè)量。納米凝膠的流體力學(xué)直徑及分布，通過動(dòng)態(tài)光散射法在納米微粒電位分析儀(Malvern Zetasizer Nano ZS90)上測(cè)量獲得。除非特別指出，所有測(cè)定均在25 ℃下水溶液中進(jìn)行，測(cè)定濃度為1 mg/ml。所有結(jié)果均為至少3次測(cè)定結(jié)果的平均值。

1.4 活體小鼠皮膚微淋巴管顯影 小鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(5 ml/kg)麻醉后，使用脫毛膏將其下肢毛發(fā)脫去。經(jīng)后爪皮下注射FDNG(1 mg/ml， 20 μl)，輕揉注射部位片刻，置熒光顯微鏡下觀察，對(duì)其下肢皮膚的微淋巴管通路進(jìn)行原位成像。

1.5 生物安全性評(píng)估 在C57小鼠注射FDNG進(jìn)行皮膚微淋巴管顯影1個(gè)月后，將小鼠用過量CO2氣體麻醉處死，對(duì)其解剖，取其肝臟、腎臟、脾臟和心臟，用4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋等。對(duì)上述器官進(jìn)行HE染色，觀察其形態(tài)學(xué)和組織學(xué)的改變。

2 結(jié)果

2.1 FDNG的表征 經(jīng)過5-AF修飾的DNG的粒徑分布仍然較窄，PDI在0.2左右，粒徑較未經(jīng)熒光修飾的納米凝膠粒徑稍大，掃描電鏡檢測(cè)脫水后的粒徑為30～50 nm；動(dòng)態(tài)光散射檢測(cè)DNG粒徑約為113 nm，F(xiàn)DNG的粒徑約為180 nm(圖2)。

2.2 活體小鼠皮膚微淋巴管顯影 小鼠下肢趾蹼皮下注射FDNG后，發(fā)現(xiàn)FDNG能夠被皮下淋巴系統(tǒng)迅速吸收并進(jìn)入下肢微淋巴管循環(huán)，在熒光顯微鏡下，活體小鼠的下肢皮膚中清晰地顯示出真皮微淋巴管的走向和分布(圖3)。

2.3 體內(nèi)生物安全性評(píng)估 小鼠注射FDNG 1個(gè)月后，對(duì)肝臟、腎臟、脾臟和心臟進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，未發(fā)現(xiàn)形態(tài)學(xué)和病理學(xué)的改變(圖4)。

3 討論

對(duì)皮膚淋巴管的研究，近年來一直進(jìn)展緩慢，很大程度上可能因?yàn)槿狈硐氲牧馨凸茱@影手段。皮膚淋巴管的走行分布、收納范圍和回流淋巴結(jié)等問題，國(guó)內(nèi)外均鮮有報(bào)道。有文獻(xiàn)報(bào)道利用淋巴管內(nèi)皮特異性免疫組化染色標(biāo)記淋巴管的方法[7-9]，可以精確標(biāo)記淋巴管。但是該方法對(duì)于觀察單張切片和小范圍情況下的淋巴管有效，而且工序繁多，無法連續(xù)觀察，且大體情況下無法辨認(rèn)淋巴管，因此不適用于觀察皮膚整體淋巴管走行和分布特征。亞甲藍(lán)直接淋巴管造影法，因其必須暴露在解剖視野中，限制了其應(yīng)用[10]；同位素淋巴管影像學(xué)造影方法因?yàn)榇嬖诜派湮廴居幸欢ǖ木窒扌訹11]。目前，對(duì)于皮膚淋巴管的分布走行特征缺乏有效的觀察方法。因此，有必要找到一種合適的方法，既能準(zhǔn)確判斷是否為淋巴管，又能準(zhǔn)確定位皮膚淋巴管的位置，且能夠觀察皮膚淋巴管整體分布和走行及其回流情況等。

一般認(rèn)為，一種好的淋巴管示蹤劑應(yīng)該具備：⑴對(duì)淋巴組織的特異性；⑵被淋巴組織吸收快，并能清楚地顯示出淋巴管；⑶在淋巴管中能夠滯留較長(zhǎng)時(shí)間；⑷成本低，無毒性。本實(shí)驗(yàn)采用的納米凝膠是由物理或者化學(xué)交聯(lián)的聚合物網(wǎng)絡(luò)組成的水凝膠顆粒[12]，它是一種納米尺度的水分散體，水中穩(wěn)定性高[13]，而且采用葡聚糖和聚丙烯酸制備，原料價(jià)格低廉，成本低，生物相容性好，毒性小，接載熒光素后熒光強(qiáng)度高，利于在熒光顯微鏡下觀測(cè)[14]。由于其粒徑可控，我們合成后將其粒徑控制在180 nm左右，使其滿足只進(jìn)入淋巴管而不進(jìn)入血管的條件，因此，將其注入趾蹼皮下后，F(xiàn)DNG能夠只走行于淋巴管中，而不會(huì)與血管混淆，我們可以在熒光顯微鏡下清晰準(zhǔn)確地觀測(cè)活體小鼠下肢皮膚中淋巴管的走行和分布?；谝陨蠋c(diǎn)，我們證明了FDNG可以用于皮膚淋巴管的顯影，示蹤皮膚淋巴管的走行和分布。但是，若應(yīng)用于臨床，還需要生物安全性的保證。因此，我們對(duì)小鼠皮下注射FDNG1個(gè)月后，對(duì)其肝臟、腎臟、脾臟和心臟進(jìn)行組織學(xué)的檢測(cè)，HE染色證實(shí)，重要器官并未發(fā)生形態(tài)學(xué)和組織學(xué)的改變，表明FDNG在體內(nèi)不會(huì)引起遠(yuǎn)期的器官損害，從一定程度上闡明了應(yīng)用的生物安全性。

圖1 FDNG的制備 圖2 FDNG的表征 a.FDNG的掃描電鏡圖像 b.DNG和FDNG的粒徑分布 圖3 小鼠下肢皮膚微淋巴管的活體成像 a. 熒光顯微鏡下小鼠下肢皮膚成像 b. 熒光顯微鏡下小鼠下肢皮膚微淋巴管影像(綠色熒光所示) 圖4 小鼠體內(nèi)注射FDNG1個(gè)月后肝臟、腎臟、脾臟和心臟的形態(tài)學(xué)和組織學(xué)變化(HE ×100)

Fig 1 Prepare of FDNG. Fig 2 Exosyndromes of FDNG. a. transmission electron microscopy images of FDNG. b. size distributions of DNG and FDNG. Fig 3 Images of micro lymphatic vessels in mouse lower extremity skins after injection of FDNG in vivo. a. images of lower extremity skin under fluorescence microscope. b. images of micro lymphatic vessels of the skin under fluorescence microscope (green). Fig 4 Histological and morphological changes of liver, kidney, spleen, and heart at 1 month after FDNG injection (HE ×100).

綜上所述，使用熒光納米凝膠示蹤法研究皮膚淋巴管的走行和分布，將為皮膚病理生理研究提供一種有效的檢測(cè)手段。雖然熒光納米凝膠作為淋巴示蹤劑，體現(xiàn)出許多優(yōu)勢(shì)，但是在熒光成像的過程中，當(dāng)受到激發(fā)光激發(fā)時(shí)，生物體部分其他物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生熒光，例如皮膚和毛發(fā)等。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度降低，因此，如何避免生物樣品的背景熒光干擾，將成為我們今后實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步深入探討和研究的內(nèi)容。

葡聚糖-聚丙烯熒光納米凝膠具有合適的粒徑，能夠特異性示蹤皮膚淋巴管的走行和分布，同時(shí)具有較好的生物安全性，為其臨床應(yīng)用提供了保證。

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Experimental research of dextran-polyacrylic acid fluorescent nanogel for skin lymphangiography

WANGHai-zhen,DAITing-ting,CUIChun-xiao,etal.

(DepartmentofDermatology,ShangqiuCentralHospital,Shangqiu476000,China)

Objective To investigate the feasibility and biosafety of fluorescent dextran-polyacrylic nanogels (FDNG) for the skin lymphangiograph. Methods Dextran and polyacrylic acid was used as raw material to synthesize fluorescent nanogel. The characteristics of FDNG were detected by Zetasizer Nano ZS90 and scan electronic microscope. FDNG was injected into subcutaeous of mouse toe web to observe the distribution and pattern of lymphatic vessels under fluorescence microscope. One month later, tissues of liver, kidney and heart tissue were harvested and examined by HE staining to testify whether there were pathological changes. Results The dextran-polyacrylic acid fluorescent nanogel was synthesized with dextran and polyacrylic acid by self-assembly one-step method, the synthesized particle diameters were around 180 nm. Pattern and distribution of skin lymphatic vessels could be clearly visualized after subcutaneous injection. The histological analysis showed that No pathological changes were found in important organs. Conclusion The dextran-polyacrylic acid fluorescent nanogel can clearly trace the distribution and pattern of skin lymphatic vessels with reliable biosafety.

Fluorescent nanogel; Lymphatic vessel; Lymphangiography; Biological safety

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81372080/21374061); 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院基金資助項(xiàng)目(2013B02)

476000 河南 商丘，商丘市中心醫(yī)院 皮膚科(王海珍);上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 整形外科(戴婷婷,崔春曉,蔣朝華);上海交通大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院金屬基復(fù)合材料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(周淑彥,竇紅靜)

王海珍(1975-)，女，河南人，副主任醫(yī)師，博士.

蔣朝華，200011，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 整形外科，電子信箱：zhhjiang@163.com；竇紅靜，200240，上海交通大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院金屬基復(fù)合材料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，電子信箱：hjdou@sjtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.06.020

R446

A

1673-7040(2015)06-0375-04

2015-03-17)