不同年齡女性脂肪干細胞生物學特性的比較

劉 洋， 尚 勇， 李 卓， 肖天舒， 郝立君

實驗研究

不同年齡女性脂肪干細胞生物學特性的比較

劉 洋， 尚 勇， 李 卓， 肖天舒， 郝立君

目的 探索不同年齡女性脂肪干細胞在細胞形態(tài)、表面標志物表達、生長特性及分化潛能方面的差異。方法 獲取不同年齡女性脂肪組織，分離出脂肪干細胞，觀察細胞形態(tài)，比較細胞增殖能力；采用流式細胞術(shù)檢測細胞的免疫表型，誘導(dǎo)分化檢測成脂、成骨分化潛能。結(jié)果 ⑴所有脂肪干細胞均呈纖維細胞樣；⑵隨著年齡的增長，脂肪干細胞的增殖能力呈下降趨勢；⑶P0代時，所有細胞均表達CD29、CD31、CD34、CD45和CD90，且隨著年齡增加，表達呈下降趨勢。傳至P4代，CD34、CD45逐漸消失，CD31表達顯著降低，CD29、CD90表達高于95%；⑷隨著年齡的增長，脂肪干細胞的成脂、成骨分化潛能均呈下降趨勢。結(jié)論 低年齡的脂肪干細胞可能具備更好的臨床應(yīng)用潛能。

脂肪干細胞； 生物學特性； 增殖能力； 分化潛能

脂肪干細胞輔助自體脂肪移植被公認為是一種安全有效的移植方法。利用自體脂肪干細胞輔助脂肪組織移植，可能成為醫(yī)學美容領(lǐng)域的最佳方案，并因此逐漸成為當前新的研究熱點之一[1-3]。多項研究提示，隨著年齡的增加，人體中干細胞在數(shù)量和生物學活性方面呈下降趨勢[4-5]。然而，不同年齡的女性脂肪干細胞生物學特性以及分化潛能等方面是否存在顯著差異，目前尚未完全證實。自2013 年12 月至 2014年 8月，筆者探索不同年齡女性脂肪干細胞在細胞形態(tài)、體外增殖能力、多種表面標志物表達和成脂、成骨分化潛能方面的差異，旨在為脂肪干細胞在醫(yī)學美容和抗衰老方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM/F12、胎牛血清(美國GIBCO公司)；Ⅰ型膠原酶、MTT、地塞米松、胰島素、吲哚美辛、異丁基甲基黃嘌呤、油紅O染料(美國SIGMA公司)；CD29、CD31、CD34、CD45、CD90抗體(美國EBIOSCIENCE公司)。

1.2 樣本來源及分組 脂肪組織來源于在哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院整形美容中心接受吸脂的22例女性，年齡19～48歲。其中，19～28歲(A組)8例；29～38歲(B組)8例；39～48歲(C組)6例。

1.3 脂肪干細胞的分離與培養(yǎng) 將脂肪組織用D-Hanks 沖洗，去除血液及其他殘留組織。將脂肪組織倒入50 ml離心管，加入等體積0.1%Ⅰ型膠原酶，37 ℃振蕩消化4 h。1000 r/min離心15 min，棄上層脂滴和液體，沉淀過濾掉組織殘渣，獲得脂肪干細胞團，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM/F12+10%胎牛血清FBS)重懸后，接種于60 mm 的細胞培養(yǎng)皿中。37 ℃培養(yǎng)48 h，換液后，在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。待細胞長滿培養(yǎng)皿后，進行傳代培養(yǎng)。

1.4 細胞增殖 取生長狀態(tài)良好的P3代脂肪干細胞，接種于24孔板，初始細胞濃度為3×103/孔，加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)，每日取3孔細胞消化、計數(shù)，取其均數(shù)，以時間(d)為橫坐標，細胞數(shù)量為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

1.5 流式細胞術(shù)檢測 將脂肪干細胞用PBS洗滌2次，1500 r/min離心5 min；用100 μl PBS緩沖液稀釋細胞，分別加入單克隆抗鼠抗人抗體CD29-PE、CD31-FITC、CD34-PE、CD45-FITC、CD90-PE，4 ℃避光孵育30 min；用4 ml PBS重懸細胞，1500 r/min離心5 min，重復(fù)洗滌2遍，500 μl PBS重懸細胞，用流式細胞儀測定。

1.6 成脂分化誘導(dǎo)及鑒定 將P4代的脂肪干細胞接種在6孔板中，待細胞融合至70%～80%，加入脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對細胞進行成脂誘導(dǎo)分化。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分為DMEM/F12+10%FBS+200 μmol/L吲哚美辛+0.5 mmol/L IBMX+10 μg/ml 胰島素+1×10-6mol/L 地塞米松。每3 d更換1次誘導(dǎo)培養(yǎng)基；誘導(dǎo)14 d后，棄培養(yǎng)基，用DPBS將細胞沖洗1遍；加入40%的油紅O稀釋液染色10 min；用75%乙醇沖洗1遍，再用蒸餾水洗1遍，光學顯微鏡下觀察拍照。

1.7 成骨誘導(dǎo)分化及鑒定 將P4代的脂肪干細胞接種在6孔板中，融合至70%～80%，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對細胞進行成骨誘導(dǎo)分化。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成分為DMEM/F12+20%FBS+20 mmol/L β-甘油磷酸鈉+50 μmol/L 維生素C+1×10-6mol/L 地塞米松。每3 d更換1次誘導(dǎo)培養(yǎng)基；誘導(dǎo)14 d后，棄培養(yǎng)基，用DPBS沖洗2遍；用4%多聚甲醛固定30 min，加入新鮮配制的堿性磷酸酶染液染色，待細胞著色明顯時，棄染料，用DPBS沖洗2遍，光學顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài) 培養(yǎng)24 h后，多數(shù)細胞開始貼壁，其形態(tài)逐漸變?yōu)殚L梭形；培養(yǎng)7 d后，各組細胞均呈典型的成纖維樣細胞形態(tài)，核橢圓，胞漿豐富，相互平行排列成束；傳至P4代時，各組細胞形態(tài)仍保持穩(wěn)定(圖1)。

2.2 增殖能力 如圖2所示，A組(19～28歲)細胞增殖能力最強，B組(29～38歲)細胞增殖能力次之，而C組(39～48歲)細胞增殖能力最弱。提示隨著年齡的增長，脂肪干細胞的增殖能力逐漸降低。

2.3 免疫表型 分別比較各組P0代和P4代細胞的免疫表型，包括CD29、CD31、CD34、CD45、CD90。發(fā)現(xiàn)P0代時，各組均表達上述分子，且A組表達最高，而C組表達最低(表1)。隨著傳代次數(shù)的增加，到P4代時，造血干細胞標志CD34和CD45幾乎消失，血管內(nèi)皮標志CD31也顯著降低，間充質(zhì)干細胞標志CD29和CD90的表達均高于95%(表2)。

表1 各組P0代細胞表面標志物的表達

表2 各組P4代細胞表面標志物的表達

2.4 成脂分化潛能 如圖3所示，誘導(dǎo)分化14d后，A組細胞明顯轉(zhuǎn)變?yōu)橛图tO染色陽性的脂肪細胞，B組中油紅O染色陽性的脂肪細胞較少，而C組中油紅O染色陽性的脂肪細胞最少。提示隨著年齡的增長，脂肪干細胞成脂分化能力逐漸減弱。

2.5 成骨分化潛能 如圖4所示，誘導(dǎo)分化14d后，A組細胞堿性磷酸酶染色呈強陽性，而C組細胞堿性磷酸酶染色結(jié)果最弱。提示隨著年齡的增長，脂肪干細胞成骨分化能力逐漸減弱。

圖1 各組脂肪干細胞形態(tài) (×100) 圖2 各組脂肪干細胞增殖能力 圖3 各組脂肪干細胞成脂分化潛能(油紅O×200) 圖4 各組脂肪干細胞成骨分化潛能(堿性磷酸酶染色 ×200)
Fig 1 ADSCs form in each group (×100). Fig 2 Proliferation of ADSCs in each group. Fig 3 Adipogenic differentiation potential of ADSCs in each group (oil red O ×200). Fig 4 Osteogenic differentiation potential of ADSCs in each group (alkaline phosphatase staining ×200).

3 討論

脂肪是人體來源最豐富的組織[2]。2001年，Zuk等[6]首次從脂肪組織中分離培養(yǎng)得到一種具有多向分化潛能的干細胞，因其與骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)相似，故稱為脂肪間充質(zhì)干細胞。近年來的研究表明，脂肪干細胞具有向脂肪、骨、軟骨、肌肉、內(nèi)皮、造血、肝、胰島和神經(jīng)等多種細胞方向分化的多分化潛能，是一種理想的種子細胞[7]。目前，脂肪干細胞的獲得，通常是通過脂肪抽吸術(shù)等方式，不會對人體產(chǎn)生明顯的不良后果。不僅如此，脂肪干細胞在體外的增殖速度快，且不需要特殊的血清，不必進行永久化處理，就能獲得足夠的細胞用于移植。目前，以脂肪干細胞作為種子細胞的脂肪組織工程有望在乳房再造術(shù)、除皺術(shù)及凹陷畸形矯正術(shù)中發(fā)揮作用[1]。

之前有研究提示，不同年齡的脂肪干細胞表現(xiàn)出一定的差異性[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著女性年齡的增長，其與造血干細胞、間充質(zhì)干細胞及內(nèi)皮祖細胞相關(guān)的表面標志物的表達，均呈下降趨勢，且成脂、成骨分化能力逐漸下降。在原代培養(yǎng)時，我們發(fā)現(xiàn)，所有細胞均表達CD29、CD31、CD34、CD45和CD90。其中，CD29和CD90為脂肪間充質(zhì)干細胞的表面標志物，CD34、CD45則主要表達于造血干細胞，而CD31通常表達于血管內(nèi)皮和內(nèi)皮祖細胞[10-12]?？梢?，獲取的原代細胞是一群由多種干細胞、祖細胞及成熟細胞組成的混合細胞。盡管如此，我們?nèi)匀话l(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，各類干祖細胞標志物的表達均呈顯著下降趨勢，提示年齡是影響人體脂肪干細胞含量的重要因素。在利用現(xiàn)有培養(yǎng)體系將細胞培養(yǎng)至第4代時，造血干細胞標志物CD34和CD45逐漸消失，而細胞主要表達間充質(zhì)干細胞標志物CD29和CD90，提示該培養(yǎng)體系更適合脂肪間充質(zhì)干細胞的生存，有助于純化和批量擴增脂肪間充質(zhì)干細胞。

成脂和成骨是脂肪間充質(zhì)干細胞最重要的分化潛能，直接決定了脂肪干細胞在臨床整形方面的應(yīng)用價值[13]。在本研究中，我們利用純化后的脂肪間充質(zhì)干細胞分別進行成脂和成骨誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)隨著女性年齡的增長，脂肪間充質(zhì)干細胞的成脂、成骨分化潛能均呈顯著下降趨勢。上述結(jié)果提示，年齡是影響脂肪間充質(zhì)干細胞進行組織器官修復(fù)和再生的重要因素。

總之，本研究表明，隨著女性年齡的增長，其脂肪干細胞的含量及多向分化潛能均顯著下調(diào)。提示在應(yīng)用脂肪干細胞進行醫(yī)學整形美容時，應(yīng)將年齡作為重要參考因素。此外，在相對年輕時保存自體脂肪干細胞，以備將來所需，是一個好的選擇。

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Comparison of biological characteristics of adipose derived stem cells in female at different ages

LIUYang,SHANGYong,LIZhuo,etal.

(CenterofPlasticandAestheticSurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Objective To explore the differences of the morphology, surface marker expression, growth characteristics, and differentiation potential of adipose stem cells obtained from females at different ages (19～48 years old). Methods The adipose tissues from females at different ages were harvested and adipose-derived stem cells were separated. Cell morphology was observed and cell proliferation was compared. Cell immunophenotypes were detected using flow cytometry. Adipogenic and osteogenic differentiation were induced. Results ⑴ All adipose-derived stem cells were fibroblast-like.⑵ The proliferation capacity of the adipose-derived stem cells was decreased with the increasing of the age. ⑶ The expression of CD29, CD31, CD34, CD45 and CD90 in all cells at passage 0 (P0) were positive and decreased with the increasing of the age. At P4, the expressions of CD34 and CD45 were gradually disappeared, with CD31 significantly decreased, while the CD29 and CD90 expressions were higher than 95%, respectively. ⑷ With the increasing of the age, their adipogenic and osteogenic differentiation potentials were decreased. Conclusion Adipose-derived stem cells from female at low age show better potentials for clinical application.

Adipose stem cell; Biological characteristics; Proliferation; Differentiation potential

150001 黑龍江 哈爾濱，哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 整形美容中心

劉 洋(1983-)，男，黑龍江哈爾濱人，主治醫(yī)師，碩士.

郝立君,150001,哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 整形美容中心,電子信箱：lijunhao368@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.06.019

R318

A

1673-7040(2015)06-0372-04

2015-01-22)