陳淑吟++陸勤勤+張美如+許廣平+陳國耀
摘要:利用ISSR標記擴增分析多個紫菜絲狀體種質材料,篩選獲得條帶穩(wěn)定表達且清晰的30個引物,其中10個引物的擴增條帶有種質特異性。利用這些ISSR引物分析不同種質的DNA指紋圖譜,可為紫菜種質評價與分子標記鑒定提供依據(jù)。
關鍵詞:紫菜;絲狀體;ISSR;種質鑒定;DNA指紋圖譜
中圖分類號: S917.3 文獻標志碼: A 文章編號:1002-1302(2015)07-0017-03
紫菜屬(Pyropia)為大型海產(chǎn)紅藻類,全世界約134種,在我國分布約22種,其中條斑紫菜(P. yezoensis)與壇紫菜(P. haitanensis)為主要栽培種類,在海藻產(chǎn)業(yè)中占有重要經(jīng)濟地位。紫菜不同種類、不同品系種質的鑒定與分析是優(yōu)良遺傳資源利用的基礎。紫菜屬物種形態(tài)特征簡單,易受環(huán)境影響,依靠傳統(tǒng)形態(tài)性狀難以準確鑒別,且隨著育種材料遺傳基礎研究的不斷深入及選育品種數(shù)目的日益增多,品種間差異越來越小。采用基于DNA水平的標記技術,有助于準確、直接獲得不同種質間的遺傳差異,將大量種質資源區(qū)分開來。由高多態(tài)性分子標記構建的指紋圖譜如SSR、SRAP等標記方法[1-5]具有明顯的個體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性,已廣泛應用于大型海洋藻類的不同種質評價、鑒定或純度分析中。ISSR標記的原理與SSR相似[6],其擴增位點具有豐富的等位變異性,是一種操作簡便、成本較低的DNA標記方法,在植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、進化與遺傳多樣性等方面有大量研究[7],在紫菜遺傳特性、親緣關系相關研究中也有不少報道[8-10]。本研究利用ISSR技術,對國家級紫菜種質庫保有的一些優(yōu)良種質資源進行遺傳特性分析,構建這些種質的特征性DNA圖譜,為紫菜種質的評價與分子標記鑒定提供依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 樣品材料與基因組總DNA提取
絲狀體樣品(表1),由江蘇省海洋水產(chǎn)研究所國家紫菜種質庫提供。取樣品絲狀體組織,用TaKaRa試劑盒(編號:DV811A)提取基因組總DNA,于4 ℃保存,備用。DNA濃度用加標準分子量電泳檢測(圖1)。
1.2 PCR擴增與圖譜分析
ISSR引物為British Columbia大學公布的第9套引物,由上[CM(25]海生工合成;MgCl2、dNTP及Taq[KG*3]DNA 聚合酶等試劑為上[CM)]
海生工產(chǎn)品;250 bp DNA marker為TaKaRa產(chǎn)品(編號:D515A)。PCR反應在Biometra PCR儀上進行,先選取3個DNA模板分組進行100條引物的PCR擴增篩選;對模板、Mg2+、dNTP濃度、引物及退火溫度等多個因子進行優(yōu)化選擇;選用優(yōu)化后的參數(shù)進行擴增反應,反應體系為25 μL,內含Mg2+2.5 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.5 mmol/L、約20 ng的DNA 模板和1.5 U Taq酶。PCR擴增反應程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃ 45 s,52 ℃ 45 s,72 ℃ 2 min,36個循環(huán);72 ℃延伸10 min。所有引物采用同一PCR反應參數(shù),擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,凝膠中含定量的溴化乙錠(EB)。由紫外分析儀觀察結果并拍照。在圖譜中,以引物每一個相同遷移位置的DNA擴增帶作為同一個位點,記為1,無帶則為0,將DNA帶的有無轉化成(0、1)數(shù)據(jù)矩陣;利用NTSYS-pc version2.10e軟件[11]計算樣品間的遺傳相似性系數(shù)(GS),用非加權組平均法(UPGMA)進行聚類分析。
2 結果與分析
2.1 引物篩選與紫菜絲狀體的特異性擴增
在設定的PCR反應條件及反應參數(shù)中,有30個引物在紫菜4個種類中穩(wěn)定擴增出DNA片段,有些引物的擴增產(chǎn)物可直接區(qū)分出不同種(表2)。少精紫菜(A5)相對于其他3個種類紫菜有明顯差異,較容易被區(qū)分出來,這些引物包括808、810、816、818、826、827、847、861、886、887;少精紫菜在引物為816的電泳圖譜中,在1 250~2 250 bp之間有3個特異條帶,在引物829的電泳圖譜中,壇紫菜(A1、A2)在1 000 bp處有1個特異條帶(圖2);條斑紫菜在500 bp及1 200 bp附近均各有1個特異條帶(圖3)。
2.2 條斑紫菜不同品系遺傳差異
由圖3可見,條斑紫菜B1-2有1個亮帶不同于其他品系;品系C1為采自青島、最早保存的純系,比另外3個較晚些的保持系(C2、C3、C4)多1或2個條帶;品系C4為最晚選育的保持系,比C1、C2、C3在約1 000 bp處少1個條帶;F組為具優(yōu)良性狀的條斑紫菜栽培品系,樣品F1比F2、F3多1個特征帶;J組為綠色株系不同培育組織的絲狀體,樣品J1、J3比樣品J2、J4多1或2個條帶;D組間的樣本沒有明顯差異。引物829可作為條斑紫菜不同品系特異性條帶的分子標記。
由圖3、圖4可見,引物888在條斑紫菜的多個種質也得到特異性表達條帶,其中:D組品系間的譜帶與引物829的有所不同,C組、J組品系間條帶表達與829的相一致;D1組樣品來自日本,其擴增結果不同于南通產(chǎn)區(qū)的D2、D3及D4,后三者條帶表達基本一樣,均在500~1 000 bp之間相同位置有3條亮帶;J1與J3條帶一樣,J2與J4結果相近,這與用引物829擴增的結果基本一致;F組中的3個優(yōu)選栽培品系譜帶均各有特異性表達。
2.3 遺傳相似性與聚類分析[JP2]
由圖5可見,在4種紫菜中,南方的壇紫菜與華北的半葉紫菜遺傳相似性為0.735 4,少精紫菜與條斑紫菜為0.705 8,條斑紫菜與壇紫菜、少精紫菜與半葉紫菜的遺傳距離相對較遠,這與崔靈英等的結論[8]相似;條斑紫菜種內各種質雖聚于一起,但樣品間的相似度相差較大,來自南通同一海域的優(yōu)選育種材料16號與17號樣品具有最大遺傳相似性,系數(shù)為0960 8,其次是10號與17號、6號與9號,相似系數(shù)分別為0921 6、0901 9。
3 結論與討論
在同一反應條件下,30個有穩(wěn)定擴增條帶的引物中有10[FL)]
個引物獲得特異性表達,以829、888等不同引物對同一種質、同一引物對不同種質擴增可以產(chǎn)生不同的特異性條帶,并得到多個種質的擴增圖譜。在這些圖譜中,不同種類或品系有獨一的指紋模式,用引物816、829可區(qū)分出少精紫菜、壇紫菜;針對27個條斑紫菜,引物829、888可用于條斑紫菜種內多個品系鑒定。樣品F3為顯示條斑紫菜形態(tài)性狀的雜交品系,ISSR擴增圖譜也多與條斑紫菜一致,這表明該標記既可構建特異性圖譜,也可反映種質屬性。有研究報道,部分引物如812、830、834、850、859、866、878、881、895等可以得到擴增產(chǎn)物[7],但由于試驗條件或試驗參數(shù)等原因,本試驗未能獲得相應的PCR產(chǎn)物,因此,充分優(yōu)化試驗參數(shù)、規(guī)范試驗操作,才有助于構建可供比較的指紋圖譜模式。
ISSR標記由于引物中帶有錨定堿基,既有高多態(tài)性又有較高穩(wěn)定性,通過單個或多個引物組合使用,即能得到可靠的結論。在一些其他大型海藻種質資源研究中,ISSR方法已是常用的研究方法之一[12-14],筆者所在實驗室也用該方法評價了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、西施舌(Coelomactra antiquata)及大黃魚(Pseudosciaena crocea)等[15-17]海產(chǎn)經(jīng)濟動物的遺傳資源狀況,并結合應用DNA序列等標記技術,檢測了ISSR方法的可靠性。筆者在探索簡便易行的種質鑒定方法時,利用ISSR已得到多個條斑紫菜品系的獨一指紋圖譜[18],這些DNA指紋標記,在資源的交換與引種等過程中可作為其品種身份信息的一個內容。
國家級紫菜種質庫收集有大量野生紫菜種質資源,并選育獲得多個優(yōu)良種質材料,如何更有效地探究這些資源的遺傳多樣性,有選擇地把優(yōu)良的遺傳變異性狀引入到栽培品種中,DNA指紋圖譜的構建無疑將為這些種質的鑒定與利用提供幫助。目前,國際植物品種權保護聯(lián)盟(UPOV) 已將DNA指紋圖譜鑒定納入農作物品種DUS測試內容[19-20]。當然,在采用ISSR 標記構建DNA指紋圖譜時,應力求簡化、規(guī)范試驗操作程序及遺傳分析方法,保證試驗數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可重復性,使構建的指紋圖譜更具有可操作性。
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