臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)中藥復(fù)方對(duì)血管平滑肌抑制作用

王萌 楊曉琨

摘要：目的觀察辛通暢絡(luò)中藥復(fù)方對(duì)慢性腎臟病心血管危險(xiǎn)因素的改善作用。方法大鼠按每天15 g/kg劑量，灌胃給藥，連續(xù)灌服10（1，于最后一次給藥后2～3h，股動(dòng)脈放血，分離血清，即為中藥血清，經(jīng)560C，30 min滅活后，分別配成含10、20、30%中藥血清的培養(yǎng)液備用，以正常大鼠血清為對(duì)照。用含辛通暢絡(luò)中藥處方不同濃度血清培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)法及四甲基偶氮唑藍(lán)（MrIr）法分別檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：24 h.72 h經(jīng)不同藥物濃度血清培養(yǎng)后，與對(duì)照組相比，培養(yǎng)24 h后，20%藥物組.30%藥物組均較其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P<0.01）；培養(yǎng)72 h后培養(yǎng)24 h后，10%藥物組較對(duì)照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P<0.05），20%藥物組.30%藥物組均較其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（Jp<0.01），結(jié)論 揭示辛通暢絡(luò)中藥復(fù)方抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，從而防治慢性腎臟病早期動(dòng)脈粥樣硬化所致的血管重構(gòu)。

關(guān)鍵詞：慢性腎臟病；辛通暢絡(luò)中藥復(fù)方；血管重構(gòu)

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007 - 2349（ 2015） 03 - 0060 - 02

心血管疾病（Cardiovascular disease，CVD）是慢性腎臟病（ chronic kidney disease，CKD）患者中最常見的并發(fā)癥，相關(guān)資料顯示，CKD病人死于CVD者在其總死亡率中高達(dá)30%～50%[1]。目前，如何干預(yù)CKD患者的CVD，尚缺乏足夠的循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。因此，在中醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)尋求有效的治療方法和藥物，是基礎(chǔ)與臨床領(lǐng)域面臨的重要課題。依據(jù)辛通暢絡(luò)中藥復(fù)方可以有效改善FSGS大鼠腎臟功能指標(biāo)，減輕腎臟病理形態(tài)學(xué)損害，同時(shí)辛通暢絡(luò)法中藥復(fù)方具有調(diào)節(jié)大血管重構(gòu)的作用，本實(shí)驗(yàn)通過確定辛通暢絡(luò)中藥復(fù)方對(duì)體外血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，以期從細(xì)胞、分子水平解析該中藥復(fù)方防治動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)大血管重構(gòu)減少心血管并發(fā)癥的機(jī)制，為該復(fù)方臨床應(yīng)用提供更充分的理論依據(jù)。1 實(shí)驗(yàn)材料及方法1.1 辛通暢絡(luò)中藥復(fù)方藥物血清的制備①辛通暢絡(luò)中藥復(fù)方的組成：柴胡12g，黃芩10g，生黃芪30g，當(dāng)歸10g，女貞子15g，澤蘭15g，水蛭10g，細(xì)辛3g；②上8味藥共煎煮3次，濃縮成100mL，汁液（4g生藥/mL），無菌裝瓶密封，以上各藥均經(jīng)天津市藥品檢驗(yàn)所核定；③實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用Spragoe -DawlPg（ SD）遠(yuǎn)交系健康大鼠48只，均為雄性，體重（250 -300）g，SPF/VAF'級(jí)，南北京華阜康生物科技股份有限公司提供（合格證號(hào)：SCXK京2009 - 0007）；④實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑：實(shí)驗(yàn)設(shè)備和試劑：胎牛血清、臺(tái)盼藍(lán)、四甲基偶氮唑藍(lán)、胰蛋白酶、DMEM均由天津子涵生物科技有限公司提供。

實(shí)驗(yàn)方法：大鼠按每天15g/kg劑量，灌胃給藥，連續(xù)灌服10天，于最后一次給藥后2～3 h，股動(dòng)脈放m，分離血清，即為中藥m清，經(jīng)56℃，30 min滅活后，分別配成含10、20、30%中藥血清的培養(yǎng)液備用，以正常大鼠血清為對(duì)照。1.2 血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定 用組織貼塊法培養(yǎng)VSMC，經(jīng)α-actin免疫組化鑒定為VSMC，第3-5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。2 實(shí)驗(yàn)生化檢測(cè)指標(biāo)和方法

用臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞汁數(shù)法檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)日細(xì)胞以1.0×105個(gè)/L的密度種于24孔板，培養(yǎng)24h后以無血清DMEM靜息24h，換成8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，分為對(duì)照組和不同濃度加藥組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h、72 h后，分別以0. 25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，取50μL，細(xì)胞懸液與50μL0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻，臺(tái)盼藍(lán)溶液終濃度為0.2%。取一滴混勻懸液加入血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，總體數(shù)據(jù)進(jìn)行組間單因素方差分析 （One Way ANOV），顯著性差異水平設(shè)定為P<0.05。4實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：24 h、72 h經(jīng)不同藥物濃度血清培養(yǎng)后，與對(duì)照組相比，培養(yǎng)24 h后，20%藥物組、30%藥物組均較其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P<0.01）；培養(yǎng)72 h后培養(yǎng)24 h后，10%藥物組較對(duì)照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P<0.05），200藥物組、30%藥物組均較其在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異（P

揭示辛通暢絡(luò)中藥復(fù)方抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，從而防治慢性腎臟病早期動(dòng)脈粥樣硬化所致的血管重構(gòu)6討論

腎臟病患者往往同時(shí)存在高血壓、高血脂、蛋白尿、低蛋白血癥、血尿、貧血、鈣磷失調(diào)等，戰(zhàn)在慢性腎臟病的早期出脫動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈硬化，從而導(dǎo)致血管病變即血管重構(gòu)。血管重構(gòu)是指機(jī)體在生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和疾病過程中，血管為適應(yīng)內(nèi)、外環(huán)境（特別是力學(xué)環(huán)境）的變化而發(fā)生形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的一系列適應(yīng)性改變，足機(jī)體對(duì)血流動(dòng)力學(xué)長(zhǎng)期改變而發(fā)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)和病理生理學(xué)過程[2]，血管重構(gòu)的中心環(huán)節(jié)是血管平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡和重組。動(dòng)脈重構(gòu)是一此心血管疾病共同的重要的病理生理改變和發(fā)病基礎(chǔ)，故而抑制動(dòng)脈重構(gòu)是減少慢性腎臟病心血管疾病的的重要環(huán)節(jié)，對(duì)降低其發(fā)病率和病死率具有重要意義。在慢性腎臟病的早期往往已出現(xiàn)心血管并發(fā)癥，其發(fā)生率隨腎功能進(jìn)展而增加，至終末期腎病（ ESRD）時(shí)達(dá)最高峰。

依據(jù)FSGS及其心血管病變足以氣推動(dòng)力虛損，樞機(jī)不利，濕濁瘀毒蘊(yùn)結(jié)，心腎脈絡(luò)損傷為基本病機(jī)，本課題以辛通暢絡(luò)，益氣和血為法，篩選組合既往臨床觀察具有療效優(yōu)勢(shì)的中藥復(fù)方為中醫(yī)干預(yù)觀察藥物。

辛通暢絡(luò)中藥復(fù)方建立的以疏利少陽法為主，融益氣養(yǎng)陰，清熱利濕，辛通暢絡(luò)、活血化瘀為一體的中藥復(fù)方制劑。在證實(shí)了腎絡(luò)寧能有效改善FSCS大鼠腎臟功能指標(biāo)，減輕腎臟病理形態(tài)學(xué)損害等實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上[3]，本研究針對(duì)慢性腎臟病患者近半數(shù)死于嚴(yán)重心血管并發(fā)癥的這一嚴(yán)重社會(huì)問題，探討腎絡(luò)寧對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)大血管重構(gòu)的作用機(jī)制，為減少慢性腎臟病患者心血管并發(fā)癥的發(fā)生、提高CKD患者生存率和生活質(zhì)量提供理論依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明辛通暢絡(luò)中藥復(fù)方能夠抑制平滑肌細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)大血管重構(gòu)，提示腎絡(luò)寧具有可推遲動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的作用，從而降低心血管疾病的危險(xiǎn)性，揭示了該藥物不僅僅是通過改善腎功能異常來減少心血管病發(fā)病的危險(xiǎn)性，同時(shí)本身具有減少慢性腎臟病的心血管疾病的作用，最終提高慢性臟病患者生存率和生活質(zhì)量。研究辛通暢絡(luò)中約復(fù)方改善慢性腎臟病心血管疾病的機(jī)制及擴(kuò)大使用范圍奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：[1] Bleumink GSS，An11dFCS，Miriam CJM，et al.Genetic polymorphism andheart failure. GenetMed ，2004，6（6）：465-474.[2]李元，龔文輝.血管重建及影響因素[J].滁州學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，7（1）：117 -120[3]楊曉琨，辛通暢絡(luò)法對(duì)FSGS腎病大鼠心血管的重構(gòu)作用及機(jī)制研究[博十學(xué)位論文].天津：天津中醫(yī)藥大學(xué)，2010

（收稿日期：2014-10-21）