維生素C拮抗草甘膦對(duì)蚯蚓急性毒性的作用

陳建華 盧敏 蔡志斌

摘要：通過赤子愛勝蚓急性毒性試驗(yàn)，探討維生素C拮抗草甘膦對(duì)蚯蚓急性毒性的作用。將蚯蚓引入草甘膦濾紙中，觀察草甘膦作用下蚯蚓的形態(tài)變化并評(píng)估草甘膦的毒性等級(jí)，結(jié)果表明：草甘膦對(duì)蚯蚓的48 h半數(shù)致死濃度為（125.35±0.06） μg/cm2，為低毒型農(nóng)藥。在試驗(yàn)濃度范圍（23.75～380.00 μg/cm2）的草甘膦中，蚯蚓體表逐漸出現(xiàn)黃色液體，表現(xiàn)為環(huán)節(jié)腫大及充血、斷尾、體節(jié)斷開等中毒現(xiàn)象。高濃度草甘膦對(duì)蚯蚓具有較強(qiáng)的致死作用，中、低濃度亦具有一定致死效應(yīng)，并隨染毒時(shí)間的延長、草甘膦濃度的升高而逐漸增加，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。向草甘膦基礎(chǔ)液中加入維生素C（0.8～100.0 mg/L）后，蚯蚓的存活率顯著提高，并隨維生素C濃度的升高而不斷提高，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。蚯蚓在含高濃度維生素C的草甘膦中未死亡，提示維生素C具有拮抗草甘膦毒性的作用。

關(guān)鍵詞：草甘膦；毒性；蚯蚓；維生素C；拮抗作用

中圖分類號(hào)： S481+.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0411-03

草甘膦（glyphosate）是20世紀(jì)70年代開發(fā)的廣譜除草劑，由于劑型較多且不具選擇性，草甘膦不僅被用于各種農(nóng)田雜草的防除，也被用于非農(nóng)田雜草的治理，如園林、苗圃、道路、林業(yè)、森林、湖泊等。目前，草甘膦已成為全球用量最大、應(yīng)用最廣的農(nóng)藥，其年銷量穩(wěn)居各農(nóng)藥之首[1]。隨著草甘膦使用量、使用范圍的增加與擴(kuò)大，農(nóng)藥噴灑、雨水沖刷、植物根系等可使草甘膦進(jìn)入環(huán)境并造成污染，目前已在全球范圍表層水體中發(fā)現(xiàn)草甘膦的存在，美國河流曾檢測到草甘膦的濃度高達(dá)2.2 mg/L[2]。殘留于蔬菜瓜果的草甘膦可進(jìn)入人體并影響人類健康。據(jù)報(bào)道，草甘膦不僅對(duì)魚類、兩棲類動(dòng)物具有急性毒性作用，對(duì)人類等哺乳動(dòng)物的肝臟、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等也具有一定毒性作用[3-8]。因此，研究如何拮抗草甘膦所引發(fā)的毒性作用具有重要實(shí)踐意義。

維生素C又名L-抗壞血酸，是一種廣泛存在于各類水果中的水溶性維生素。維生素C作為具有抗癌、抗腫瘤作用的抗氧化劑進(jìn)入生物體后，可清除體內(nèi)自由基，抑制某些化學(xué)物質(zhì)氧化為致癌物，并能阻斷致癌物的活化，同時(shí)參與體內(nèi)氨基酸的代謝與神經(jīng)遞質(zhì)的合成，以提高患者的抵抗力。此外，維生素C還具有解毒功能。本試驗(yàn)擬以環(huán)境土壤模式動(dòng)物蚯蚓為材料，探討草甘膦對(duì)土壤生物的急性毒性作用，并研究維生素C拮抗草甘膦對(duì)蚯蚓急性毒性的作用，旨在為機(jī)體內(nèi)草甘膦毒性的防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）購自福建省福州市鰲峰花鳥市場，于試驗(yàn)室馴養(yǎng)1周后，選取體色鮮亮、行動(dòng)活躍、體節(jié)完好、環(huán)帶明顯、大小一致、體質(zhì)量為400～500 mg的蚯蚓進(jìn)行試驗(yàn)。草甘膦購自福州市農(nóng)藥化肥經(jīng)營部，為30%水劑，試驗(yàn)時(shí)稀釋為10.24 g/L的草甘膦母液。維生素C購自福州海王福藥制藥有限公司。

1.2 草甘膦對(duì)蚯蚓急性毒性試驗(yàn)

1.2.1 蚯蚓清腸處理 于直徑9 cm的培養(yǎng)皿底部鋪置1層濾紙，用蒸餾水潤濕后，將洗凈的蚯蚓置于其中，以保鮮膜封口，并用橡皮圈捆緊防止蚯蚓跑出，在保鮮膜上扎孔通氣，于室溫下清腸24 h。

1.2.2 急性毒性試驗(yàn) 采用濾紙法對(duì)蚯蚓進(jìn)行染毒試驗(yàn)。設(shè)置不同濃度的草甘膦試驗(yàn)組和清水對(duì)照組，取試驗(yàn)組和對(duì)照組溶液各3 mL潤濕濾紙，分別置于9 cm直徑的培養(yǎng)皿中，使各培養(yǎng)皿的草甘膦終濃度分別為380.00、190.00、95.00、47.50、23.75、0.00 μg/cm2。各濃度培養(yǎng)皿中投入5條蚯蚓，設(shè)置4個(gè)平行試驗(yàn)。投入蚯蚓后6 h內(nèi)觀察其活動(dòng)變化，并分別于24、48、72、96 h統(tǒng)計(jì)蚯蚓的死亡情況，以蚯蚓尾部對(duì)機(jī)械刺激無反應(yīng)視為死亡。通過寇氏法計(jì)算得出48 h草甘膦對(duì)蚯蚓的半數(shù)致死濃度LC50及其95%置信限。寇氏法計(jì)算公式為：LC50=lg-1[Xm-i（∑P-0.5）]，式中：Xm為最大劑量組劑量對(duì)數(shù)值，i為相鄰2組對(duì)數(shù)劑量的差值，P為各組動(dòng)物死亡率，∑P為各組動(dòng)物死亡率總和；LC50的標(biāo)準(zhǔn)誤sLC50=i×（∑P-∑P2）/（n-1），其中n為各組動(dòng)物數(shù)；LC50的95%置信限=lg-1（lgLC50±1.96×sLC50）[9]。

按表1對(duì)濾紙法測定的草甘膦毒性進(jìn)行等級(jí)評(píng)估[10]。

1.3 維生素C對(duì)草甘膦所致蚯蚓急性毒性的拮抗試驗(yàn)

根據(jù)48 h時(shí)LD50的95%置信上下限，選取95%置信下限的草甘膦濃度為拮抗試驗(yàn)基礎(chǔ)液的濃度，在此濃度草甘膦中加入不同濃度的維生素C作為試驗(yàn)組。試驗(yàn)組的維生素C終濃度分別為20.0、4.0、0.8 mg/L。試驗(yàn)設(shè)置清水對(duì)照組、草甘膦基礎(chǔ)液對(duì)照組、系列濃度的維生素C試驗(yàn)組，分別取不同試驗(yàn)用液3 mL浸濕濾紙并置于相應(yīng)培養(yǎng)皿中，各培養(yǎng)皿放入5條蚯蚓，設(shè)2個(gè)平行試驗(yàn)組。在6 h內(nèi)觀察蚯蚓的活動(dòng)情況，并分別于24、48 h統(tǒng)計(jì)蚯蚓的死亡情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 11.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)的線性回歸關(guān)系，以相關(guān)系數(shù)r表示相關(guān)程度，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦對(duì)蚯蚓的急性毒性

2.1.1 蚯蚓的中毒表現(xiàn) 試驗(yàn)開始6 h內(nèi)觀察時(shí)，清水對(duì)照組的蚯蚓在濾紙中自由爬行，一段時(shí)間后部分蚯蚓聚集成團(tuán)；草甘膦試驗(yàn)組的蚯蚓在濾紙中爬行一段時(shí)間后，表現(xiàn)出對(duì)草甘膦濾紙的回避，分別爬到濾紙下方、濾紙與皿壁邊緣、培養(yǎng)皿豎側(cè)邊緣，有些甚至爬到保鮮膜與培養(yǎng)皿的縫隙中；在高濃度草甘膦（190～380 μg/cm2）試驗(yàn)組中，部分蚯蚓體表分泌黃色液體。24 h觀察時(shí)，380 μg/cm2草甘膦試驗(yàn)組的濾紙上出現(xiàn)很多黃斑，蚯蚓保持靜止，身體拉長并貼于培養(yǎng)皿邊緣，部分蚯蚓開始死亡，部分蚯蚓呈“假死”狀態(tài)，用牙簽刺激蚯蚓尾部會(huì)使其迅速蜷成團(tuán)。48 h觀察時(shí)，高濃度草甘膦（190～380 μg/cm2）試驗(yàn)組的大多數(shù)蚯蚓環(huán)節(jié)腫大、充血，并出現(xiàn)斷尾、尾部體節(jié)斷開，呈“藕斷絲連”的形態(tài)，蚯蚓死亡數(shù)量增大。

2.1.2 草甘膦對(duì)蚯蚓的致死效應(yīng) 由表2可知，蚯蚓在清水對(duì)照組中可正常存活96 h，而草甘膦試驗(yàn)組中的蚯蚓則呈現(xiàn)不同的死亡率。中、低濃度的草甘膦（23.75～95.00 μg/cm2）對(duì)蚯蚓毒性作用較弱，可使其存活24 h，并于48 h內(nèi)出現(xiàn)死亡，草甘膦對(duì)蚯蚓的致死效應(yīng)隨染毒時(shí)間的延長而增強(qiáng)，蚯蚓在中濃度草甘膦（95 μg/cm2）中的耐受時(shí)間不超過96 h。高濃度草甘膦（190～380 μg/cm2）對(duì)蚯蚓的致死效應(yīng)較強(qiáng)，24 h內(nèi)即可致死部分蚯蚓，而380 μg/cm2草甘膦中的蚯蚓于48 h內(nèi)全部死亡。

由表2可知，草甘膦對(duì)蚯蚓的48 h半數(shù)致死濃度為（125.35±0.06） μg/cm2，介于100.00～1 000.00 μg/cm2 之間，根據(jù)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，草甘膦對(duì)蚯蚓的毒性等級(jí)為低毒。

2.1.3 草甘膦濃度與致死效應(yīng)的關(guān)系 由圖1可知，在各作用濃度下染毒時(shí)間相同的蚯蚓，72 h內(nèi)死亡率隨草甘膦濃度的升高而升高，兩者呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。以草甘膦濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)同一染毒時(shí)間蚯蚓的死亡率進(jìn)行回歸分析，其相關(guān)性具有顯著意義（P<0.05）。染毒時(shí)間達(dá)96 h時(shí)，各濃度草甘膦對(duì)蚯蚓的致死率均接近100%，因此，染毒96 h后蚯蚓死亡率不再隨草甘膦濃度的升高而升高，兩者間的相關(guān)性沒有顯著意義（P>0.05）。

2.1.4 染毒時(shí)間與致死效應(yīng)的關(guān)系 由圖2可知，在同一濃度（23.75～190.00 μg/cm2）的草甘膦作用下，蚯蚓死亡率隨染毒時(shí)間的延長而上升，兩者呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。以染毒時(shí)間為橫坐標(biāo)，對(duì)蚯蚓死亡率進(jìn)行回歸分析，其相關(guān)性具有顯著意義（P<0.05）。蚯蚓在高濃度草甘膦（380 μg/cm2）中僅能生存48 h，因此死亡率不再隨染毒時(shí)間的延長而上升，兩者間的相關(guān)性沒有顯著意義（P>0.05）。

2.2 維生素C對(duì)致死效應(yīng)的拮抗作用

以濃度低于48 h半數(shù)致死濃度95%置信下限的草甘膦（95 μg/cm2）為對(duì)照組，在此基礎(chǔ)上加入不同濃度的維生素C以進(jìn)行蚯蚓致死拮抗試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)不同濃度組蚯蚓的存活率。結(jié)果（圖3）顯示：向草甘膦基礎(chǔ)液中加入0.8～100.0 mg/L的維生素C可明顯提高蚯蚓存活率，且存活率隨維生素C濃度的升高而升高，兩者呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。以維生素C濃度為橫坐標(biāo)對(duì)蚯蚓存活率進(jìn)行回歸分析，其相關(guān)性具有顯著意義（P<0.05）。向草甘膦基礎(chǔ)液中加入高濃度（100 mg/L）的維生素C可完全拮抗草甘膦對(duì)蚯蚓的致死效應(yīng)，使蚯蚓的存活數(shù)量、生活狀態(tài)皆與清水對(duì)照組相似。

3 結(jié)論與討論

草甘膦已被證實(shí)為低毒性，從而使其在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用更加無節(jié)制。土壤中殘留的草甘膦由根吸收并積累于農(nóng)作物體內(nèi)[11]。目前已在食品、動(dòng)物飼料中檢測到草甘膦，大豆中的草甘膦含量甚至高達(dá)17 mg/kg。有資料顯示，草甘膦在白菜中代謝緩慢，大棚噴藥5 d后仍能檢測到超標(biāo)的草甘膦[12]。草甘膦可通過各種途徑進(jìn)入食品，并通過食物鏈最終進(jìn)入人體，此類低毒型農(nóng)藥對(duì)人類健康的影響已引起廣泛關(guān)注。草甘膦及其代謝產(chǎn)物氨甲基磷酸不僅可以損傷DNA，還可干擾DNA的修復(fù)，從而影響細(xì)胞周期的檢測點(diǎn)，細(xì)胞周期功能的失調(diào)將導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定，增加人類患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[11，13]。草甘膦通過誘發(fā)染色體斷裂、DNA損傷對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生的遺傳毒性已在小鼠等哺乳動(dòng)物試驗(yàn)中得到證實(shí)[14-15]。厄瓜多爾的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與草甘膦噴灑區(qū)邊界80 km外的居民相比，草甘膦噴灑區(qū)域的居民具有較高程度的DNA損傷[16]，可見草甘膦對(duì)人類遺傳同樣具有潛在毒性。Benachour等用遠(yuǎn)低于農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的含量，或低于糧食、飼料中殘留的草甘膦濃度對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、293胚胎腎細(xì)胞、JEG3胎盤細(xì)胞株進(jìn)行染毒，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞于24 h內(nèi)全部死亡，提示低濃度草甘膦對(duì)人類細(xì)胞也具有一定毒性[17]。對(duì)草甘膦的生殖毒性研究表明：一方面，草甘膦通過改變睪丸雄激素受體的表達(dá)而改變其血清睪酮與雌二醇的分布，最終影響生殖細(xì)胞的產(chǎn)生；另一方面，草甘膦可誘導(dǎo)機(jī)體過氧化水平的增高，從而破壞細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷及DNA損害，使精子數(shù)量減少、畸形率上升[18]。對(duì)大白兔的試驗(yàn)表明，草甘膦可使其體質(zhì)量與性欲降低，并導(dǎo)致異常精子、死精子的比例增加[19-21]。有關(guān)流行病學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，暴露于草甘膦的孕婦早產(chǎn)與流產(chǎn)的比例增加，且后代兒童存在生育缺陷、患多動(dòng)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加了2.6倍[11，22]?？梢姴莞熟㈦m為低毒性，進(jìn)入人體后對(duì)細(xì)胞、遺傳、生殖系統(tǒng)等仍存在威脅。2008年，巴西對(duì)草甘膦進(jìn)行了重新評(píng)估以確認(rèn)其對(duì)人類健康的影響，官方建議將其毒性等級(jí)由第4級(jí)（微毒）提升為第1級(jí)（劇毒）[23]。如何降低或緩解草甘膦毒性已迫在眉睫。草甘膦對(duì)動(dòng)物的制毒機(jī)制尚未明確，可能與以下因素有關(guān)：誘發(fā)DNA損傷；干擾激素的合成；使機(jī)體產(chǎn)生過量氧自由基從而導(dǎo)致細(xì)胞的毒性作用[11，18，24]。

維生素C為水溶性維生素，廣泛存在于各類蔬菜、水果中，具有解毒、預(yù)防癌癥、抗氧化、消除自由基等作用，是人體必需的營養(yǎng)素。動(dòng)物試驗(yàn)表明，維生素C通過調(diào)控bcl-2、p53的表達(dá)使DNA免受化學(xué)誘導(dǎo)劑造成的損害，提示維生素C可拮抗草甘膦引起的遺傳毒性[25-27]。同時(shí)，維生素C作為抗氧化劑具有強(qiáng)大的清除自由基能力，可通過還原反應(yīng)消除有害自由基對(duì)細(xì)胞的毒性作用。試驗(yàn)前期工作已證明維生素C對(duì)草甘膦誘發(fā)的斑馬魚急性毒性、遺傳毒性具有緩解作用，本研究通過蚯蚓的急性毒性試驗(yàn)再次證明維生素C可緩解草甘膦誘發(fā)的急性毒性。

草甘膦應(yīng)用廣泛，雖為低毒性但仍可通過食物鏈對(duì)人體健康造成威脅。經(jīng)常于飯后食用新鮮水果進(jìn)行維生素C的補(bǔ)充，將有利于緩解微量草甘膦對(duì)人體造成的危害。

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