鹽堿化草坪土壤耐鹽解磷真菌的篩選及解磷能力研究

李學平 劉萍 李甲亮 吳海楠

摘要：采集草坪根際鹽堿化土壤進行菌種篩選，并研究培養(yǎng)條件對菌株解磷效果的影響。試驗結(jié)果表明，真菌菌株FL0908發(fā)酵液中的有效磷濃度為310.23 mg/L，真菌解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）達到1.96。菌株FL0908在所供4種碳源條件下均能生長，不同碳源生長差異顯著，最適碳源為葡萄糖，而在乳糖培養(yǎng)基上生長最差；對于所供4種氮源，在酵母浸膏上生長過于迅速，在亞硝酸鈉條件下幾乎不生長，最適氮源為酵母浸膏，硝酸鉀次之；對于所供4種溫度，真菌均可生長，最適溫度為30 ℃；在所供的4種pH值條件下可正常生長，最適pH值為6。對于試驗中發(fā)酵液條件的優(yōu)化組合，最適解磷條件為：溫度35 ℃，pH值7，碳氮比35 ∶1，轉(zhuǎn)速130 r/min。

關(guān)鍵詞：解磷真菌；生物學特性；鹽堿土；根際

中圖分類號： S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0368-03

磷肥作為作物必需的營養(yǎng)物質(zhì)對農(nóng)業(yè)效益的提高具有重大作用，但是施入土壤后由于土壤的固定作用，大部分磷與土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+結(jié)合，形成難溶性磷酸鹽[1]，大大降低了肥料的有效性。在土壤性質(zhì)、作物類型、磷肥種類和用量等一系列因素的影響下，每年施入的磷有75%～90%積累在土壤中成為難溶形態(tài)的磷[2]，當季利用率一般為10%～25%[3]；因此，如何提高磷肥利用率一直是研究人員關(guān)注的重要問題。解磷微生物是土壤中能將難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物能夠吸收利用的可溶性磷的一類特殊功能微生物類群[4]。土壤中解磷微生物主要包括細菌、真菌和放線菌。關(guān)于解磷細菌的研究較多，也較深入[5-6]。關(guān)于解磷真菌方面的研究相對較少，但因為其具有解磷能力強的特點，一直也是研究的熱點[7]。對不同種類解磷微生物溶磷效果的研究發(fā)現(xiàn)，細菌、酵母、霉菌接種在不同磷源上時，表現(xiàn)出的溶磷能力不同[8-12]。解磷真菌在數(shù)量和種類上都少于解磷細菌，但其解磷能力遠遠高于解磷細菌，而且遺傳性狀更加穩(wěn)定[13]。因此，研究解磷真菌的解磷特性以及生物學特性，對促進植物生長發(fā)育以及解磷真菌在農(nóng)學上的應(yīng)用有重要作用。本試驗采集草坪根際土壤，對解磷菌進行篩選并研究培養(yǎng)條件對菌株解磷效果的影響，同時對發(fā)酵液條件優(yōu)化組合進行了研究，探討解磷真菌的最適生長環(huán)境以及解磷的最適合條件。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

采集內(nèi)陸鹽堿地草坪根際土壤，采用抖土法將收集的土樣放入密封袋內(nèi)立刻帶回實驗室冷藏，備用。

1.2 培養(yǎng)基配方

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

菌種初篩用的是有機磷固體培養(yǎng)基和無機磷固體培養(yǎng)基。（1）有機磷固體培養(yǎng)基配方：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0.2 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0～7.5。（2）無機磷固體培養(yǎng)基配方：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，Ca3（PO4）2 5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值7.0～7.5。

1.2.2 保存培養(yǎng)基

菌種保存時用到的培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基，其配方為：葡萄糖 15 g，NaNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，KCl 025 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，瓊脂 8 g，蒸餾水500 mL，自然pH值。

1.2.3 復(fù)篩培養(yǎng)基 菌種復(fù)培（純化）時用的培養(yǎng)基為有機磷液體培養(yǎng)基和無機磷液體培養(yǎng)基。（1）有機磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 001 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0.2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值 7.0～7.5。（2）無機磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，Ca3（PO4）2 5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值7.0～7.5。

1.2.4 活化培養(yǎng)基

經(jīng)過觀察，獲知純化所得的菌種為真菌，所以活化時用到的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其配方為：葡萄糖 20 g，馬鈴薯（去皮）200 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。配制方法是將馬鈴薯去皮，切成小塊，于鍋中加水 1 000 mL，煮沸30 min，用雙層紗布過濾，取其濾液，之后加入葡萄糖和瓊脂，小火加熱并用玻璃棒不斷攪拌，至瓊脂完全溶解，并加水補足1 000 mL。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵條件優(yōu)化組合采用的培養(yǎng)基為無機培養(yǎng)基和有機培養(yǎng)基。（1）有機培養(yǎng)基配方：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0.2 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值7.0～75。（2）無機培養(yǎng)基配方：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，Ca（PO4）2 5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值 7.0～7.5。

以上培養(yǎng)基制作完成之后均在高壓滅菌鍋中，于 121 ℃、0.103 MPa條件下滅菌20 min。

1.2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化組合

本試驗中發(fā)酵條件優(yōu)化組合采用的是4因子（溫度、pH值、碳氮比、轉(zhuǎn)速）3水平的正交試驗（表1），根據(jù)試驗結(jié)果，綜合分析確定菌株生長的最適條件。

1.3 菌株篩選

1.3.1 初篩

按照培養(yǎng)基配方與配量分別稱取各藥品，取少于總量的水于燒杯中，將各培養(yǎng)基成分（瓊脂除外）逐一加入水中待溶；將玻璃杯放在石棉網(wǎng)上文火加熱，并不斷攪拌，使各藥品快速溶解，然后補充水分至所需配制培養(yǎng)基的量；用 1 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5；將配制好的培養(yǎng)基分裝在錐形瓶內(nèi)，加上棉塞包裝滅菌。高壓滅菌后倒平板，次日，將采集的土壤過篩磨細，稱取10 g樣品，進行梯度稀釋至1×10-7、1×10-8、1×10-9，分別滴加菌液于相應(yīng)編號的平板表面，每個梯度做3個重復(fù)，用涂布器涂布均勻，20～30 min后倒置，并放于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。每天觀察平板，并記錄菌落出現(xiàn)的日期、菌落解磷能力出現(xiàn)日期、菌落直徑d、解磷圈出現(xiàn)日期及直徑D。培養(yǎng)7 d后，得到解磷能力比較強的菌株進行純化培養(yǎng)，將純化培養(yǎng)幾代的菌株進行菌種保存。

1.3.2 復(fù)篩

采用液體發(fā)酵培養(yǎng)法，將解磷微生物培養(yǎng)在難溶性磷液體培養(yǎng)基上，按照配方配制液體培養(yǎng)基進行高壓滅菌，在超凈工作臺上，按照無菌接種法，接種純化后的解磷真菌于發(fā)酵液中，置于搖床中，在30 ℃、120 r/min轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)7 d，每天觀察發(fā)酵液的變化，并記錄菌絲球的出現(xiàn)日期、菌絲球顏色、目測其大小。發(fā)酵結(jié)束后，進行發(fā)酵液有效磷測定。

1.3.3 生物學測定

本次試驗采用察氏培養(yǎng)基進行試驗，其配方如下：碳源30 g，NaNO3 2 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷真菌菌株篩選

通過菌種初篩和復(fù)篩，得到真菌菌株FL0908發(fā)酵液中的有效磷濃度為310.23 mg/L。真菌解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）隨時間延長而增大，菌株FL0908在4 d增幅最大，在生長到5 d時，解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）趨于穩(wěn)定，菌株FL0908的D/d達到最大值1.96（表2）。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)性狀

通過觀察結(jié)果（表3）顯示，菌株FL0908的上清液較為透明，粗略判斷菌株FL0908的解磷能力較強。

2.3 培養(yǎng)條件對解磷能力的影響

2.3.1 不同碳源對真菌生長的影響 真菌菌株FL0908在供試的4種碳源營養(yǎng)條件下均能生長，生長趨勢基本一致，但是對葡萄糖的利用最好，對乳糖的利用最差（圖1）。不同碳源不僅對真菌菌株FL0908的菌落直徑影響較大，對菌絲體及菌落形態(tài)同樣產(chǎn)生較為顯著的影響。在葡萄糖培養(yǎng)基上，菌絲體較為粗壯，菌落濃密，在培養(yǎng)基背面產(chǎn)生較明顯的黑色次生代謝物；在蔗糖和乳糖培養(yǎng)基上生長出的菌絲比較稀疏，顏色亦較淺。

2.3.2 不同氮源對真菌生長的影響

不同氮源對真菌菌株FL0908生長的影響較大（圖2）。真菌菌株FL0908在NaNO2上基本不生長，在其他不同氮源培養(yǎng)基上均能生長。其中在酵母浸膏上生長過于迅速，在KNO3和NaNO3上能正常生長。從整個過程來看，真菌菌株FL0908在酵母浸膏培養(yǎng)基上生長最好，在NaNO2培養(yǎng)基上生長最差。不同氮源不僅對真菌菌株FL0908的菌落直徑影響較大，對其菌絲體及菌落形態(tài)同樣產(chǎn)生較為顯著的影響。真菌菌株FL0908在酵母浸膏和KNO3培養(yǎng)基上生長出比較濃密的菌絲；在NaNO2培養(yǎng)基上菌落顏色比較淡，菌落外圍形成白色的生長圈，而且菌絲變?yōu)楹谏钑r間更長。

2.3.3 不同溫度對真菌生長的影響

真菌菌株FL0908在供試的4個不同溫度條件下均能生長，但在不同溫度條件下的生長狀況差異較顯著。在培養(yǎng)3 d內(nèi)，真菌菌株FL0908在 35 ℃ 條件下生長最快，在20 ℃條件下生長最差，在培養(yǎng)3 d后，35 ℃條件下的菌落生長速率減慢；生長到 4 d后，在30 ℃條件下生長最好，在20 ℃條件下生長最差（圖3）。不同溫度對真菌菌株FL0908的菌絲體及菌落形態(tài)影響不顯著，在溫度為25、30、35 ℃條件下菌絲都比較濃密，在20 ℃條件下菌落顏色比較淡。

2.3.4 不同pH值對真菌生長的影響

真菌菌株FL0908在供試的4種pH值條件下均能生長，在培養(yǎng)3 d內(nèi)，在pH值為6時生長最快，菌落直徑達到28 mm；生長到4 d時，pH值為5時菌落生長速率最快；綜合整個過程來看，在pH值為6時生長最好，在pH值為8時生長最差（圖4）。pH值為5、6、7這3種酸堿度下真菌菌株FL0908的菌落形態(tài)基本無顯著差異，菌落濃密；pH值為8時生長最差，顏色暗淡，菌落稀疏。

2.4 發(fā)酵條件研究

菌株FL0908不同試驗組發(fā)酵液有效磷含量差異較大（表4）。酸堿度的極差最大，是影響發(fā)酵液有效磷含量的關(guān)鍵性因子，碳氮比極差最小，對發(fā)酵液有效磷含量影響較小。根據(jù)各試驗因子的平均數(shù)可以看出：因素A選擇水平3，因素B選擇水平2，因素C選擇水平1，因素D選擇水平2，為最優(yōu)組合，即溫度為35 ℃，pH值為7，碳氮比為35 ∶1，轉(zhuǎn)速為 130 r/min。

3 結(jié)論

篩選獲得1株解磷特性比較好的真菌菌株FL0908，對其解磷能力進行研究，真菌解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）達到1.96。

真菌菌株FL0908在供試的4種碳源營養(yǎng)條件下均能生長，不同碳源條件下差異顯著，最適碳源為葡萄糖，而在乳糖培養(yǎng)基上生長最差；對于所供4種氮源，在酵母浸膏上生長過于迅速，在亞硝酸鈉條件下幾乎不生長，最適氮源為酵母浸膏，硝酸鉀次之。

對于所供4種溫度，真菌均可生長，菌株FL0908的最適溫度為30 ℃；在所供的4種pH值條件下可正常生長，最適酸堿度為pH值為6。

對于試驗中發(fā)酵液條件的優(yōu)化組合，真菌菌株FL0908最適解磷條件為：溫度35 ℃，pH值7，碳氮比35 ∶1，轉(zhuǎn)速130 r/min。

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