酶法提取葡萄酒廢酵母胞壁多糖的工藝

李雙石 張虎成 李浡 吳志明 冀振紅

摘要：通過單因素和正交試驗(yàn)，對(duì)葡萄酒廢酵母多糖的超聲波提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳提取工藝條件為：中性蛋白酶加酶量0.3%、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間1.5 h、pH值6.0，在此工藝條件下酵母胞壁多糖提取率可達(dá)13.67%。

關(guān)鍵詞：葡萄酒廢酵母；多糖；酶法提取；工藝優(yōu)化；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： TS261.1+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0311-03

葡萄酒廢酵母是葡萄酒釀造的主要副產(chǎn)物之一，其排放量約占葡萄酒產(chǎn)量的4%～5%[1]。葡萄酒酵母泥富含營(yíng)養(yǎng)，將其直接排放，不僅會(huì)造成排水的生物耗氧量負(fù)荷，而且也會(huì)造成很大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。因此，葡萄酒廢酵母的高效再利用已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。

酵母多糖是酵母細(xì)胞壁的主要組分，占酵母細(xì)胞壁干質(zhì)量的40%左右[2]。已有研究表明，酵母胞壁多糖主要有葡聚糖、甘露聚糖和少量幾丁質(zhì)組成，它們具有良好的生物活性，如抗輻射、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等。在食品工業(yè)中，酵母胞壁多糖還能充當(dāng)乳化劑、增稠劑、低熱食品原料等[3]。如葡萄酒釀造業(yè)中可選擇在不同釀酒階段添加酵母多糖制品，用于防止酒石酸鹽結(jié)晶、增加香氣復(fù)雜度、改善葡萄酒特定或整體品質(zhì)的目的[2]。

由于酵母胞壁多糖在菌體細(xì)胞中多與蛋白質(zhì)、脂類等物質(zhì)以絡(luò)合物的形式存在，因此需要對(duì)胞壁多糖進(jìn)行分離提取后再加以利用。目前，關(guān)于啤酒廢酵母多糖提取工藝研究較多[4-8]，但利用葡萄酒廢酵母提取多糖的研究還很少[9，10]。酵母多糖常用提取技術(shù)有自溶法[4]、堿溶法[4，7，9]、微波輔助提取法[5]、超聲波輔助提取法[8，10]等，其中堿溶法操作簡(jiǎn)單、成本低，但提取時(shí)間過長(zhǎng)、提取率低；超聲波輔助提取法和微波輔助提取法提取時(shí)間短，但其設(shè)備成本和能耗較高；自溶法具有工藝過程復(fù)雜、提取率低等缺陷。與上述幾種方法相比，酶法由于具有反應(yīng)條件溫和、選擇性強(qiáng)、設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)，近年來已被廣泛用于酵母多糖的提取[4，6]，但采用生物酶法提取葡萄酒廢酵母多糖的研究尚未見報(bào)道。

本研究以葡萄酒廢酵母為原料，以多糖提取率為衡量指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)法[11-13]優(yōu)化酵母胞壁多糖提取工藝參數(shù)，以期為葡萄酒廢酵母資源的開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄酒廢酵母泥：北京電子科技職業(yè)學(xué)院葡萄酒中試生產(chǎn)自產(chǎn)，采自2013年11月。

中性蛋白酶和堿性蛋白酶購(gòu)自成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司，胃蛋白酶購(gòu)自北京芳草醫(yī)藥工業(yè)研制公司，木瓜蛋白酶購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，β-葡聚糖酶購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)儀器

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司），可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒廢棄酵母預(yù)處理 將葡萄酒泥與蒸餾水以 1 ∶1 混合，用60目篩篩分，4 000 r/min離心20 min。重復(fù)上述步驟，直至所得沉淀為白色，上清液無色透明為止，收集沉淀，60 ℃鼓風(fēng)干燥處理，磨粉。

1.3.2 葡萄酒廢酵母多糖的提取 精確稱取0.200 g酵母泥粉加至20 mL活化后的酶液中，對(duì)菌懸液進(jìn)行不同生物酶（胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蝸牛酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶）、不同酶量（0.1%～0.4%）、不同溫度（40～60 ℃）、不同時(shí)間（0.5～3.0 h）和不同pH值（4.0～7.0）的酶解處理，離心，取上清，量取提取液的總體積v，將提取液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)n，檢測(cè)提取液中多糖含量c，計(jì)算酵母多糖提取率。

酵母多糖提取率=CVn/m×100%，C為粗提液中多糖濃度，V為粗提液體積，n為粗提液稀釋倍數(shù)，m為廢酵母粉質(zhì)量。

1.3.3 多糖含量的測(cè)定 多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸比色法。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（40 μg/mL）0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL置于比色管中，補(bǔ)蒸餾水至2.0 mL，再加入1.0 mL 6%苯酚后，置冷水中迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻后于冷水中放置5 min，然后置沸水浴中加熱15 min，再置冷水中放置5 min，最后于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度。以2.0 mL蒸餾水按同樣顯色操作為空白樣。以吸光度D為縱坐標(biāo)，以多糖濃度C（μg/mL，以葡萄糖計(jì)）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

粗提液中多糖含量的測(cè)定：用2.0 mL多糖粗提液代替葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和水的混和物，用同樣的顯色方法測(cè)定粗提液中多糖含量。

1.3.4 多糖提取條件優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)條件優(yōu)化 分別對(duì)生物酶種類、加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間和酶解液pH值進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)葡萄酒廢酵母多糖提取率的影響。

1.3.4.2 正交試驗(yàn)條件優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定葡萄酒廢酵母多糖提取正交試驗(yàn)的因素和水平（表1）。采用4因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)葡萄酒廢酵母多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過檢測(cè)不同葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，求得多糖濃度C與吸光度D的回歸方程：D=0.021 5C+0.000 6（r2=0.999 7），標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1所示。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 不同酶對(duì)葡萄酒廢酵母多糖提取率的影響 各種酶制劑對(duì)酵母細(xì)胞壁的破壁效果不同，本試驗(yàn)采用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蝸牛酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶等5種生物酶對(duì)廢棄葡萄酒酵母進(jìn)行破壁處理。將各種酶制劑分別以0.2%的添加量加入至20 mL 40 ℃的蒸餾水中活化30 min；然后分別加入0.200 g酵母泥粉，攪勻，調(diào)節(jié)pH值至6.0；置于60 ℃水浴提取1 h；離心、取上清，檢測(cè)提取液中多糖含量，并計(jì)算多糖提取率（圖2）。結(jié)果表明，用中性蛋白酶處理葡萄酒酵母可獲得最好的酵母破壁效果和最高的多糖提取率。

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)葡萄酒廢酵母多糖提取率的影響 將中性蛋白酶以0.2%的添加量加入至20 mL 40 ℃蒸餾水中活化30 min；調(diào)節(jié)酶液pH值至6.0；精確稱取0.200 g酵母泥粉6份，加至酶液中，60 ℃水浴分別提取0.5、1、1.5、2、2.5、3 h；離心、取上清，檢測(cè)提取液中多糖含量，計(jì)算多糖提取率（圖3）。結(jié)果表明，當(dāng)酶解時(shí)間少于1.5 h時(shí)，酵母多糖提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)迅速增加；但當(dāng)酶解時(shí)間多于1.5 h時(shí)，酵母多糖

提取率略有降低。這可能是由于酶解時(shí)間過長(zhǎng)，提取出的多糖大分子結(jié)構(gòu)斷裂，使多糖提取率下降。因此，從提取效果和生產(chǎn)效率角度考慮，1.5 h是適宜的酶解時(shí)間。

2.2.3 加酶量對(duì)葡萄酒廢酵母多糖提取率的影響 將中性蛋白酶分別以0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、035%、0.40%的添加量加入至20 mL 40 ℃蒸餾水中活化 30 min；調(diào)節(jié)酶液pH值至6.0，稱取0.200 g酵母泥粉7份加至酶液中，60 ℃水浴提取1 h；離心、取上清，檢測(cè)提取液中多糖含量，計(jì)算多糖提取率（圖4）。結(jié)果表明，隨著酶用量的加大，多糖提取率也逐漸增加，但酶用量增大到0.25%以后，多糖得率又略有下降。這可能是由于隨著酶用量的增加，少量多糖可能產(chǎn)生了一定的降解作用，結(jié)果導(dǎo)致多糖提取率有所降低。因此，0.25%為較優(yōu)酶量。

2.2.4 酶解pH值對(duì)葡萄酒廢酵母多糖提取率的影響 將7份中性蛋白酶以0.2%的添加量加入至20 mL 40 ℃蒸餾水中活化30 min；調(diào)節(jié)酶液pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、60、6.5、7.0；稱取0.200 g酵母泥粉7份，分別加至不同pH值酶液中，60 ℃水浴提取1 h；離心，取上清，檢測(cè)提取液中多糖含量，計(jì)算多糖提取率（圖5）。結(jié)果表明，酶液pH值對(duì)多糖提取效果影響很大，在pH值從4.0升高到6.5時(shí)，多糖提取率達(dá)到最高（11.58%），隨后隨著pH值的升高，多糖提取率開始下降。因此，中性蛋白酶液pH值為6.5時(shí)，多糖提取效果最好，此時(shí)可能中性蛋白酶活性最高。

2.2.5 酶解溫度對(duì)葡萄酒廢酵母多糖提取率的影響 將中性蛋白酶以0.2%的添加量，加入至20 mL 40 ℃蒸餾水中活化30 min；調(diào)節(jié)酶液pH值至6.0；精確稱取0.200 g酵母泥粉5份，加至酶液中，分別于40、45、50、55、60 ℃水浴提取1 h；離心、取上清，檢測(cè)提取液中多糖含量，計(jì)算多糖提取率（圖6）。結(jié)果表明，酶解溫度對(duì)葡萄酒廢酵母的多糖提取率影響較大。隨著溫度從40 ℃逐漸升高到50 ℃，多糖的提取率逐漸增加，其中在50 ℃時(shí)多糖提取率最高，為12.89%。這可能是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)溫度的升高有助于提高中性蛋白酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)酵母細(xì)胞壁的酶解和多糖的釋放。但當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，過高的溫度降低了酶的活性，導(dǎo)致多糖提取率下降。因此，50 ℃是適宜的酶解溫度。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)葡萄酒廢酵母多糖提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)，以葡萄酒廢酵母多糖提取率為指標(biāo)，確定多糖最佳生物酶解提取工藝條件為中性蛋白酶加酶量0.3%、酶解溫度 50 ℃、pH值6.0、酶解時(shí)間1.5 h，此條件下葡萄酒酵母泥多糖得率為 13.67%。此外極差分析發(fā)現(xiàn)，各因素對(duì)葡萄酒廢酵母多糖提取率的影響程度依次為酶解溫度>酶解時(shí)間>pH值>酶量，即酶解溫度對(duì)多糖提取率的影響最大，其次為酶解時(shí)間，而加酶量和酶液pH值的影響較小。

3 結(jié)論

葡萄酒廢酵母細(xì)胞壁中含有豐富的多糖組分，本研究采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)葡萄酒廢酵母胞壁多糖的生物酶法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳提取工藝條件為中性蛋白酶加酶量0.3%、酶解溫度50 ℃、pH值6.0、酶解時(shí)間 1.5 h，此工藝條件下葡萄酒廢酵母多糖提取率可達(dá)13.67%。該提取方法操作簡(jiǎn)便、多糖提取率高，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究結(jié)果為葡萄酒生產(chǎn)中廢棄物的資源化再利用提供重要參考。

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