木薯粉乙醇清液發(fā)酵中糖化條件的研究

陳俊英 劉永麗 黃會(huì)杰 武文竹 李洪亮 方書(shū)起

摘要：在木薯粉液化工藝確定的條件下，研究木薯粉糖化性能，用糖化后的濾清液發(fā)酵乙醇。先將木薯粉完全液化，經(jīng)降溫、調(diào)pH值后，以水為提取液，考察糖化時(shí)間、糖化酶用量、液料比等單因素對(duì)糖化工藝的影響，并著重分析了液料比對(duì)發(fā)酵乙醇濃度的影響；由于糖含量過(guò)高會(huì)影響乙醇發(fā)酵的結(jié)果，以最終乙醇濃度為考察目標(biāo)，在單因素的基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)糖化工藝進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)所得較佳條件為：液料比2.5 mL ∶1 g，糖化酶用量為200 U/g（木薯粉），糖化時(shí)間105 min；并按此條件進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，所得結(jié)果與響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果一致，表明該模型可用于木薯糖化試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與預(yù)測(cè)。

關(guān)鍵詞：木薯；發(fā)酵；乙醇；糖化

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ920.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0272-04

目前，在石油資源緊缺、原油價(jià)格不斷攀升、環(huán)境壓力日益加重的情況下，燃料乙醇作為一種清潔的可再生能源應(yīng)運(yùn)而生[1-3]。燃料乙醇作為車(chē)用液體燃料，在交通運(yùn)輸方面有著太陽(yáng)能、風(fēng)能、水能等其他可再生能源不可替代的作用。木薯淀粉含量極高，且是非糧作物，利用木薯為原料有利于保障國(guó)家能源安全和糧食安全，比利用玉米、小麥、甘蔗等原料更經(jīng)濟(jì)，社會(huì)效益也較為突出[4-9]。

利用木薯粉進(jìn)行乙醇發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵液的黏度過(guò)大會(huì)對(duì)多罐連續(xù)發(fā)酵中物料的流動(dòng)造成極大影響，也給醪液的攪拌、加熱、冷卻帶來(lái)很大困難。木薯在收集時(shí)也易混入砂石、金屬等雜物，容易引起機(jī)械設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn)部位的磨損，使換熱器堵塞，機(jī)器發(fā)生故障，降低使用壽命。砂石進(jìn)入生產(chǎn)線(xiàn)后，會(huì)在發(fā)酵罐、蒸餾塔中沉積，造成管道設(shè)備堵塞，清洗困難，引起染菌、升酸等問(wèn)題[10]，同時(shí)也增加了物耗、能耗，造成生產(chǎn)不穩(wěn)定。為了解決這些問(wèn)題，應(yīng)盡可能地減少糖損失，本研究采用清液發(fā)酵的方式除砂并降低醪液黏度，主要對(duì)清液發(fā)酵的糖化條件進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

木薯粉，河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司；液化酶：耐高溫α-淀粉酶，酶活力為76 999 U/mL，河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司；糖化酶：酶活力為73 800 U/mL，河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司；菌種：耐高溫活性干酵母（TH-AADY），湖北安琪生物集團(tuán)有限公司；硫酸、氫氧化鈉、碘、碘化鉀、3，5-二硝基水楊酸等化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2012PC），龍尼柯儀器有限公司；酒度計(jì)，河北省武強(qiáng)縣同輝儀表廠(chǎng)；旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)（NDJ-79），同濟(jì)大學(xué)機(jī)電廠(chǎng)；精密酸度計(jì)（PHS-3C），上海大普儀器有限公司；電子天平（AL204），梅特勒-托利多儀器有限公司；智能水浴鍋（HH-S6），鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；循環(huán)水多用真空泵（SHZ-D），上海予英儀器有限公司。

1.3 測(cè)定方法

還原糖的測(cè)定：3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[11-12]，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：y=3.949 7x+0.073 7（r2=0.999 4），其中x為吸光度，y為葡萄糖濃度（mg/mL）。

乙醇的測(cè)定：酒度計(jì)法[13]。

黏度測(cè)定：用NDJ-79型旋轉(zhuǎn)式黏度計(jì)。

1.4 木薯原料分析

木薯中的水分含量采用105 ℃恒質(zhì)量法測(cè)定；木薯中淀粉含量根據(jù)文獻(xiàn)[13]中的方法測(cè)定。

1.5 液化醪液的制備

經(jīng)前期單因素試驗(yàn)確定液化條件為：以液料比 2.5 mL ∶1 g 進(jìn)行潤(rùn)料，按1 g木薯粉加入20 U的量添加液化酶，60 ℃預(yù)熱10 min后在95 ℃液化，1 h后碘檢；液化完成后，將液化醪液降溫到60 ℃，調(diào)節(jié)pH值至4.5，供糖化試驗(yàn)用。

1.6 木薯糖化條件的單因素試驗(yàn)研究

預(yù)先將液化酶與拌料水混合，然后加入木薯粉調(diào)漿，再置于水浴鍋中，升溫液化；碘檢顯示液化結(jié)束后，攪拌降溫至糖化溫度，調(diào)節(jié)pH值，加入糖化酶后保溫一段時(shí)間；糖化結(jié)束后抽濾，取清液加入活化酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵，待發(fā)酵完成后檢測(cè)乙醇濃度。

1.6.1 糖化時(shí)間對(duì)糖化的影響 在液化后的醪液中按1 g木薯粉添加150 U的量加入糖化酶，置于60 ℃恒溫水浴鍋中，考察不同糖化時(shí)間對(duì)糖化的影響。

1.6.2 糖化酶用量對(duì)糖化的影響 在液化醪液中分別加入不同量的糖化酶，其他操作條件不變，考察糖化酶量對(duì)糖化的影響。

1.6.3 液料比對(duì)糖化的影響 以不同液料比進(jìn)行潤(rùn)料，其他操作條件不變，考察不同液料比對(duì)糖化的影響。

1.6.4 液料比對(duì)發(fā)酵的影響 以不同液料比潤(rùn)料，考察不同液料比對(duì)發(fā)酵（主要指乙醇濃度）的影響。

1.7 木薯糖化工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以不同的液料比潤(rùn)料，加入液化酶量為20 U/g（木薯粉），60 ℃預(yù)熱10 min后在95 ℃液化，液化1 h后碘檢，液化完成后將醪液降溫到60 ℃，調(diào)節(jié)pH值至45，加入一定量糖化酶，在60 ℃糖化不同時(shí)間后，將糖化醪液進(jìn)行抽濾，在濾液中加入活化后的酵母，放入恒溫?fù)u床中，在37 ℃下發(fā)酵72 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)乙醇濃度。以糖化酶用量、糖化時(shí)間、液料比為影響因素，應(yīng)用Design Expert 軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試，響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

1.8 優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

以?xún)?yōu)化后的糖化工藝條件進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.9 液化醪液、糖化醪液、清液的黏度

以液料比2.5 mL ∶1 g進(jìn)行潤(rùn)料，考察加入液化酶和不加液化酶的木薯粉漿在升溫過(guò)程中的黏度變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯原料分析

木薯粉中含有一定的水分，采用105 ℃恒質(zhì)量法測(cè)定，其平均含水量為10.52%。通過(guò)對(duì)木薯中淀粉含量的測(cè)定，得到其平均淀粉含量為76.23%。

2.2 木薯的糖化條件研究

2.2.1 糖化時(shí)間對(duì)糖化的影響 由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，延長(zhǎng)糖化時(shí)間可增加糖化醪液里還原糖的含量；但超過(guò)一定時(shí)間后，糖化速度越來(lái)越慢，致使還原糖含量的增量很小，反而增加了能耗，降低了設(shè)備利用率[14]。還原糖的含量在糖化時(shí)間為30～90 min內(nèi)一直增加，過(guò)了90 min后還原糖含量幾乎不變，可見(jiàn)糖化進(jìn)行90 min后，糖化過(guò)程已基本完成?？紤]到能耗和設(shè)備利用率，糖化過(guò)程一般進(jìn)行90 min左右即可。

2.2.2 糖化酶用量對(duì)糖化的影響 從圖2可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著糖化酶用量的增加，清液中的還原糖含量增大。在糖化酶用量為100～175 U的范圍內(nèi)，還原糖含量有明顯的變化趨勢(shì)，增加糖化酶用量，糖化效果顯著提高；當(dāng)繼續(xù)增加糖化酶用量時(shí)，還原糖含量變化不大，表明繼續(xù)增加酶用量對(duì)糖化效果的提高意義不大。從經(jīng)濟(jì)性上考慮，初步選取糖化酶的添加量為175 U/g（木薯粉）。

2.2.3 液料比對(duì)糖化的影響 由圖3可知，還原糖含量隨著液料比的增大即水的增加而降低，且變化顯著。雖然液料比2.0 mL ∶1 g時(shí)，還原糖含量最高，但過(guò)高的糖度會(huì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生抑制，繼而降低發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇量[5]。為了確定合適的液料比，又研究了不同液料比對(duì)發(fā)酵的影響。

2.2.4 液料比對(duì)發(fā)酵的影響 從圖4中可以看出，乙醇濃度隨著液料比的增大先增加后降低。雖然還原糖含量在液料比2.0 mL ∶1 g時(shí)最高，但發(fā)酵后所得乙醇濃度卻不是最高的，說(shuō)明此時(shí)清液中的糖含量已對(duì)酵母的發(fā)酵產(chǎn)生了抑制；當(dāng)液料比為2.5 mL ∶1 g時(shí)，發(fā)酵的乙醇濃度最高。綜合考慮原料及經(jīng)濟(jì)因素，采用2.5 mL ∶1 g作為較合適的液料比。

2.3 木薯糖化工藝優(yōu)化

以發(fā)酵后的乙醇濃度（Y）為響應(yīng)值，響應(yīng)面的試驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示。

使用Design Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了回歸擬合，得到了乙醇濃度和各個(gè)影響因素間的關(guān)系回歸方程：

Y=13.23+0.34X1+0.013X2+0.20X3+0.13X1X2+015X1X3-0.10X2X3-0.25X12-0.50X22-0.33X32。

由表3、表4可知，P<0.05，說(shuō)明該模型顯著，而失擬項(xiàng)為不顯著。試驗(yàn)中各因素對(duì)乙醇濃度的影響殘差為0.020，說(shuō)明該模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合比較好[15-16]。此模型的R2=0.966 0，表明數(shù)據(jù)的相關(guān)性較好；而校正R2=0.904 8，說(shuō)明90.48%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可由此模型解釋?zhuān)M(jìn)一步說(shuō)明了模型與實(shí)際情況擬合較好；變異系數(shù)可以表示試驗(yàn)的精確度，變異系數(shù)值越大，表明試驗(yàn)的可靠度越小，在本試驗(yàn)中變異系數(shù)值為1.11%，表明試驗(yàn)操作可靠；信噪比>4時(shí)，表明該模型可用于預(yù)測(cè)，本試驗(yàn)信噪比為11.414，表明模型的選擇適當(dāng)，有充足的信號(hào)，可用于試驗(yàn)設(shè)計(jì)[17-20]。

從圖5可以看出，當(dāng)液料比固定時(shí)，乙醇濃度隨著糖化酶用量的增加出現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象，說(shuō)明適當(dāng)?shù)奶腔赣昧靠梢蕴岣咛腔褐械倪€原糖量。當(dāng)糖化酶用量固定時(shí)，乙醇濃度隨著水用量的增加而先增大后降低，在液料比為 2.5 mL ∶1 g 時(shí)乙醇濃度最大。水用量過(guò)少時(shí)，糖化液黏度增大，給物料的流動(dòng)帶來(lái)困難，更使得糖化液中還原糖的含量過(guò)高，進(jìn)而抑制了乙醇的發(fā)酵；當(dāng)水用量過(guò)多時(shí)降低了醪液中還原糖的含量，乙醇濃度也隨之降低。當(dāng)糖化時(shí)間固定時(shí)，乙醇濃度隨著糖化酶用量呈先增大后降低的趨勢(shì)。當(dāng)糖化酶用量固定時(shí)，乙醇濃度隨著糖化時(shí)間呈現(xiàn)先增大后降低的現(xiàn)象，在糖化時(shí)間為105 min時(shí)乙醇濃度最高。

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)，可確定木薯粉糖化工藝的最佳條件為：糖化酶用量為200 U/g（木薯粉），液料比為2.5 mL ∶1 g，糖化時(shí)間為105 min。

2.4 優(yōu)化工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

以?xún)?yōu)化后的糖化工藝條件進(jìn)行3組平行驗(yàn)證性試驗(yàn)，所得乙醇濃度結(jié)果分別為13.2%、13.3%、13.0%，平均乙醇體積濃度為13.17%，與理論值13.34%較接近，相對(duì)誤差為127%，表明該模型可以用于試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與預(yù)測(cè)。

2.5 液化醪液、糖化醪液、清液的黏度

由圖6可知，液化酶明顯降低了木薯醪液的黏度。當(dāng)溫度低于61 ℃時(shí)，物料的黏度變化都很小；當(dāng)溫度繼續(xù)上升，在62～67 ℃之間時(shí)黏度迅速升高，進(jìn)入了吸水膨脹和糊化階段[21]，若醪液在此之前能混合均勻，就可降低糊化對(duì)液化不完全的影響。超過(guò)糊化溫度后，淀粉分子隨著各分子之間鍵的削弱而斷開(kāi)，黏度也開(kāi)始下降[22]。

液化、糖化過(guò)程中醪液黏度的變化如圖7所示，由于液化酶和糖化酶的水解作用，醪液中的黏度都很低。醪液的黏度均在液化、糖化進(jìn)行30 min后維持在一定值，糖化醪液中的黏度在糖化結(jié)束即糖化進(jìn)行105 min后黏度依然沒(méi)變，為 22 mPa·s。由于糖化酶的作用，糖化醪液中的黏度低于液化醪液中的黏度。糖化結(jié)束后經(jīng)抽濾所得清液的黏度為 2.2 mPa·s，僅為醪液黏度的10%，表明清液發(fā)酵明顯降低了用于發(fā)酵的醪液黏度。

3 結(jié)論與討論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化了糖化條件，優(yōu)化后的糖化條件為：糖化酶量200 U/g（木薯粉）、液料比2.5 mL ∶1 g，糖化時(shí)間105 min。3次驗(yàn)證試驗(yàn)所得乙醇體積濃度的平均值為13.17%，與理論值13.34%較接近，表明該模型可用于試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與預(yù)測(cè)。

本研究還測(cè)定了液化、糖化過(guò)程中醪液及清液的黏度，結(jié)果表明使用清液發(fā)酵降低了發(fā)酵醪液的黏度，提高了物料的流動(dòng)性。

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