木薯粉乙醇清液發(fā)酵中糖化條件的研究

陳俊英 劉永麗 黃會杰 武文竹 李洪亮 方書起

摘要：在木薯粉液化工藝確定的條件下，研究木薯粉糖化性能，用糖化后的濾清液發(fā)酵乙醇。先將木薯粉完全液化，經(jīng)降溫、調(diào)pH值后，以水為提取液，考察糖化時間、糖化酶用量、液料比等單因素對糖化工藝的影響，并著重分析了液料比對發(fā)酵乙醇濃度的影響；由于糖含量過高會影響乙醇發(fā)酵的結(jié)果，以最終乙醇濃度為考察目標，在單因素的基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面法對糖化工藝進行了優(yōu)化。試驗所得較佳條件為：液料比2.5 mL ∶1 g，糖化酶用量為200 U/g（木薯粉），糖化時間105 min；并按此條件進行了驗證試驗，所得結(jié)果與響應(yīng)面試驗結(jié)果一致，表明該模型可用于木薯糖化試驗的設(shè)計與預(yù)測。

關(guān)鍵詞：木薯；發(fā)酵；乙醇；糖化

中圖分類號：TQ920.6 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0272-04

目前，在石油資源緊缺、原油價格不斷攀升、環(huán)境壓力日益加重的情況下，燃料乙醇作為一種清潔的可再生能源應(yīng)運而生[1-3]。燃料乙醇作為車用液體燃料，在交通運輸方面有著太陽能、風(fēng)能、水能等其他可再生能源不可替代的作用。木薯淀粉含量極高，且是非糧作物，利用木薯為原料有利于保障國家能源安全和糧食安全，比利用玉米、小麥、甘蔗等原料更經(jīng)濟，社會效益也較為突出[4-9]。

利用木薯粉進行乙醇發(fā)酵時，發(fā)酵液的黏度過大會對多罐連續(xù)發(fā)酵中物料的流動造成極大影響，也給醪液的攪拌、加熱、冷卻帶來很大困難。木薯在收集時也易混入砂石、金屬等雜物，容易引起機械設(shè)備運轉(zhuǎn)部位的磨損，使換熱器堵塞，機器發(fā)生故障，降低使用壽命。砂石進入生產(chǎn)線后，會在發(fā)酵罐、蒸餾塔中沉積，造成管道設(shè)備堵塞，清洗困難，引起染菌、升酸等問題[10]，同時也增加了物耗、能耗，造成生產(chǎn)不穩(wěn)定。為了解決這些問題，應(yīng)盡可能地減少糖損失，本研究采用清液發(fā)酵的方式除砂并降低醪液黏度，主要對清液發(fā)酵的糖化條件進行了研究。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

木薯粉，河南天冠企業(yè)集團有限公司；液化酶：耐高溫α-淀粉酶，酶活力為76 999 U/mL，河南天冠企業(yè)集團有限公司；糖化酶：酶活力為73 800 U/mL，河南天冠企業(yè)集團有限公司；菌種：耐高溫活性干酵母（TH-AADY），湖北安琪生物集團有限公司；硫酸、氫氧化鈉、碘、碘化鉀、3，5-二硝基水楊酸等化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 試驗儀器

紫外可見分光光度計（UV-2012PC），龍尼柯儀器有限公司；酒度計，河北省武強縣同輝儀表廠；旋轉(zhuǎn)式黏度計（NDJ-79），同濟大學(xué)機電廠；精密酸度計（PHS-3C），上海大普儀器有限公司；電子天平（AL204），梅特勒-托利多儀器有限公司；智能水浴鍋（HH-S6），鄭州長城科工貿(mào)有限公司；循環(huán)水多用真空泵（SHZ-D），上海予英儀器有限公司。

1.3 測定方法

還原糖的測定：3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法[11-12]，建立標準曲線為：y=3.949 7x+0.073 7（r2=0.999 4），其中x為吸光度，y為葡萄糖濃度（mg/mL）。

乙醇的測定：酒度計法[13]。

黏度測定：用NDJ-79型旋轉(zhuǎn)式黏度計。

1.4 木薯原料分析

木薯中的水分含量采用105 ℃恒質(zhì)量法測定；木薯中淀粉含量根據(jù)文獻[13]中的方法測定。

1.5 液化醪液的制備

經(jīng)前期單因素試驗確定液化條件為：以液料比 2.5 mL ∶1 g 進行潤料，按1 g木薯粉加入20 U的量添加液化酶，60 ℃預(yù)熱10 min后在95 ℃液化，1 h后碘檢；液化完成后，將液化醪液降溫到60 ℃，調(diào)節(jié)pH值至4.5，供糖化試驗用。

1.6 木薯糖化條件的單因素試驗研究

預(yù)先將液化酶與拌料水混合，然后加入木薯粉調(diào)漿，再置于水浴鍋中，升溫液化；碘檢顯示液化結(jié)束后，攪拌降溫至糖化溫度，調(diào)節(jié)pH值，加入糖化酶后保溫一段時間；糖化結(jié)束后抽濾，取清液加入活化酵母進行乙醇發(fā)酵，待發(fā)酵完成后檢測乙醇濃度。

1.6.1 糖化時間對糖化的影響 在液化后的醪液中按1 g木薯粉添加150 U的量加入糖化酶，置于60 ℃恒溫水浴鍋中，考察不同糖化時間對糖化的影響。

1.6.2 糖化酶用量對糖化的影響 在液化醪液中分別加入不同量的糖化酶，其他操作條件不變，考察糖化酶量對糖化的影響。

1.6.3 液料比對糖化的影響 以不同液料比進行潤料，其他操作條件不變，考察不同液料比對糖化的影響。

1.6.4 液料比對發(fā)酵的影響 以不同液料比潤料，考察不同液料比對發(fā)酵（主要指乙醇濃度）的影響。

1.7 木薯糖化工藝優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以不同的液料比潤料，加入液化酶量為20 U/g（木薯粉），60 ℃預(yù)熱10 min后在95 ℃液化，液化1 h后碘檢，液化完成后將醪液降溫到60 ℃，調(diào)節(jié)pH值至45，加入一定量糖化酶，在60 ℃糖化不同時間后，將糖化醪液進行抽濾，在濾液中加入活化后的酵母，放入恒溫搖床中，在37 ℃下發(fā)酵72 h，發(fā)酵結(jié)束后測乙醇濃度。以糖化酶用量、糖化時間、液料比為影響因素，應(yīng)用Design Expert 軟件設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試，響應(yīng)面試驗因素水平見表1。

1.8 優(yōu)化工藝驗證試驗

以優(yōu)化后的糖化工藝條件進行3組平行驗證試驗。

1.9 液化醪液、糖化醪液、清液的黏度

以液料比2.5 mL ∶1 g進行潤料，考察加入液化酶和不加液化酶的木薯粉漿在升溫過程中的黏度變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯原料分析

木薯粉中含有一定的水分，采用105 ℃恒質(zhì)量法測定，其平均含水量為10.52%。通過對木薯中淀粉含量的測定，得到其平均淀粉含量為76.23%。

2.2 木薯的糖化條件研究

2.2.1 糖化時間對糖化的影響 由圖1可知，在一定范圍內(nèi)，延長糖化時間可增加糖化醪液里還原糖的含量；但超過一定時間后，糖化速度越來越慢，致使還原糖含量的增量很小，反而增加了能耗，降低了設(shè)備利用率[14]。還原糖的含量在糖化時間為30～90 min內(nèi)一直增加，過了90 min后還原糖含量幾乎不變，可見糖化進行90 min后，糖化過程已基本完成?？紤]到能耗和設(shè)備利用率，糖化過程一般進行90 min左右即可。

2.2.2 糖化酶用量對糖化的影響 從圖2可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著糖化酶用量的增加，清液中的還原糖含量增大。在糖化酶用量為100～175 U的范圍內(nèi)，還原糖含量有明顯的變化趨勢，增加糖化酶用量，糖化效果顯著提高；當(dāng)繼續(xù)增加糖化酶用量時，還原糖含量變化不大，表明繼續(xù)增加酶用量對糖化效果的提高意義不大。從經(jīng)濟性上考慮，初步選取糖化酶的添加量為175 U/g（木薯粉）。

2.2.3 液料比對糖化的影響 由圖3可知，還原糖含量隨著液料比的增大即水的增加而降低，且變化顯著。雖然液料比2.0 mL ∶1 g時，還原糖含量最高，但過高的糖度會對發(fā)酵產(chǎn)生抑制，繼而降低發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇量[5]。為了確定合適的液料比，又研究了不同液料比對發(fā)酵的影響。

2.2.4 液料比對發(fā)酵的影響 從圖4中可以看出，乙醇濃度隨著液料比的增大先增加后降低。雖然還原糖含量在液料比2.0 mL ∶1 g時最高，但發(fā)酵后所得乙醇濃度卻不是最高的，說明此時清液中的糖含量已對酵母的發(fā)酵產(chǎn)生了抑制；當(dāng)液料比為2.5 mL ∶1 g時，發(fā)酵的乙醇濃度最高。綜合考慮原料及經(jīng)濟因素，采用2.5 mL ∶1 g作為較合適的液料比。

2.3 木薯糖化工藝優(yōu)化

以發(fā)酵后的乙醇濃度（Y）為響應(yīng)值，響應(yīng)面的試驗方案及結(jié)果如表2所示。

使用Design Expert 8.0軟件對試驗結(jié)果進行了回歸擬合，得到了乙醇濃度和各個影響因素間的關(guān)系回歸方程：

Y=13.23+0.34X1+0.013X2+0.20X3+0.13X1X2+015X1X3-0.10X2X3-0.25X12-0.50X22-0.33X32。

由表3、表4可知，P<0.05，說明該模型顯著，而失擬項為不顯著。試驗中各因素對乙醇濃度的影響殘差為0.020，說明該模型與試驗數(shù)據(jù)擬合比較好[15-16]。此模型的R2=0.966 0，表明數(shù)據(jù)的相關(guān)性較好；而校正R2=0.904 8，說明90.48%的試驗數(shù)據(jù)可由此模型解釋，進一步說明了模型與實際情況擬合較好；變異系數(shù)可以表示試驗的精確度，變異系數(shù)值越大，表明試驗的可靠度越小，在本試驗中變異系數(shù)值為1.11%，表明試驗操作可靠；信噪比>4時，表明該模型可用于預(yù)測，本試驗信噪比為11.414，表明模型的選擇適當(dāng)，有充足的信號，可用于試驗設(shè)計[17-20]。

從圖5可以看出，當(dāng)液料比固定時，乙醇濃度隨著糖化酶用量的增加出現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象，說明適當(dāng)?shù)奶腔赣昧靠梢蕴岣咛腔褐械倪€原糖量。當(dāng)糖化酶用量固定時，乙醇濃度隨著水用量的增加而先增大后降低，在液料比為 2.5 mL ∶1 g 時乙醇濃度最大。水用量過少時，糖化液黏度增大，給物料的流動帶來困難，更使得糖化液中還原糖的含量過高，進而抑制了乙醇的發(fā)酵；當(dāng)水用量過多時降低了醪液中還原糖的含量，乙醇濃度也隨之降低。當(dāng)糖化時間固定時，乙醇濃度隨著糖化酶用量呈先增大后降低的趨勢。當(dāng)糖化酶用量固定時，乙醇濃度隨著糖化時間呈現(xiàn)先增大后降低的現(xiàn)象，在糖化時間為105 min時乙醇濃度最高。

根據(jù)響應(yīng)面試驗，可確定木薯粉糖化工藝的最佳條件為：糖化酶用量為200 U/g（木薯粉），液料比為2.5 mL ∶1 g，糖化時間為105 min。

2.4 優(yōu)化工藝驗證試驗

以優(yōu)化后的糖化工藝條件進行3組平行驗證性試驗，所得乙醇濃度結(jié)果分別為13.2%、13.3%、13.0%，平均乙醇體積濃度為13.17%，與理論值13.34%較接近，相對誤差為127%，表明該模型可以用于試驗的設(shè)計與預(yù)測。

2.5 液化醪液、糖化醪液、清液的黏度

由圖6可知，液化酶明顯降低了木薯醪液的黏度。當(dāng)溫度低于61 ℃時，物料的黏度變化都很小；當(dāng)溫度繼續(xù)上升，在62～67 ℃之間時黏度迅速升高，進入了吸水膨脹和糊化階段[21]，若醪液在此之前能混合均勻，就可降低糊化對液化不完全的影響。超過糊化溫度后，淀粉分子隨著各分子之間鍵的削弱而斷開，黏度也開始下降[22]。

液化、糖化過程中醪液黏度的變化如圖7所示，由于液化酶和糖化酶的水解作用，醪液中的黏度都很低。醪液的黏度均在液化、糖化進行30 min后維持在一定值，糖化醪液中的黏度在糖化結(jié)束即糖化進行105 min后黏度依然沒變，為 22 mPa·s。由于糖化酶的作用，糖化醪液中的黏度低于液化醪液中的黏度。糖化結(jié)束后經(jīng)抽濾所得清液的黏度為 2.2 mPa·s，僅為醪液黏度的10%，表明清液發(fā)酵明顯降低了用于發(fā)酵的醪液黏度。

3 結(jié)論與討論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面試驗優(yōu)化了糖化條件，優(yōu)化后的糖化條件為：糖化酶量200 U/g（木薯粉）、液料比2.5 mL ∶1 g，糖化時間105 min。3次驗證試驗所得乙醇體積濃度的平均值為13.17%，與理論值13.34%較接近，表明該模型可用于試驗的設(shè)計與預(yù)測。

本研究還測定了液化、糖化過程中醪液及清液的黏度，結(jié)果表明使用清液發(fā)酵降低了發(fā)酵醪液的黏度，提高了物料的流動性。

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