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    姚江水系中華鱉不同組織3種同工酶的表達(dá)差異

    2015-08-20 02:59:06鄭小青梅依霞洪炆飛汪財生唐偉錢國英李彩燕
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年7期
    關(guān)鍵詞:同工酶酯酶表達(dá)

    鄭小青 梅依霞 洪炆飛 汪財生 唐偉 錢國英 李彩燕

    摘要:采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法,對姚江水系中華鱉(Pelodiscus sinensis)的6種組織(心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、肺)中的乳酸脫氫酶(LDH)、酯酶(EST)、谷氨酸脫氫酶(GDH) 3種同工酶進(jìn)行了初步研究,并與日本品系中華鱉的同工酶譜圖進(jìn)行了對比。結(jié)果表明:2個品系中華鱉的同工酶具有不同程度的組織特異性,LDH組織差異極為明顯;姚江水系中華鱉相同組織LDH整體表達(dá)量與日本中華鱉類似,EST-1表達(dá)量高于日本中華鱉,GDH整體表達(dá)量低于日本中華鱉,肌肉中GDH-3表達(dá)量高于日本中華鱉。本研究得到了姚江群體中華鱉的標(biāo)志性酶譜,并明確了其與日本品系中華鱉酶譜的差異和特殊性。

    關(guān)鍵詞:中華鱉;同工酶;表達(dá);組織特異性;乳酸脫氫酶;酯酶;谷氨酸脫氫酶

    中圖分類號: S917.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2015)07-0244-03

    中華鱉(Pelodiscus sinensis)又稱水魚、團(tuán)魚、元魚、甲魚等,是我國重要的特種經(jīng)濟(jì)動物和名特優(yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。近10余年來,在養(yǎng)鱉業(yè)蓬勃發(fā)展的同時,人們對野生資源的不合理開發(fā)加劇,中華鱉的生存形勢持續(xù)惡化,原種資源不斷減少。過度的食用消費(fèi)、棲息地的破壞、化學(xué)污染等因素導(dǎo)致我國中華鱉種質(zhì)資源遭受嚴(yán)重破壞,種群面臨大規(guī)模銳減、瀕臨滅絕的境地,尤其是一些特殊地域種群的原種地沒有引起足夠的重視。如主要分布在寧波姚江流域的姚江水系中華鱉原種已處于瀕危狀態(tài),野生種質(zhì)資源稀缺。該群體中華鱉抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性好、肉質(zhì)鮮美、膠質(zhì)濃郁,深受消費(fèi)者喜愛。姚江水系中華鱉除了具有中華鱉的基本固有特征外,主要特征為腹部有4處明顯花斑,與其他品系中華鱉差異非常明顯。目前,關(guān)于中華鱉同工酶的研究大多集中于黃河群體、太湖群體和臺灣群體[1-3],而姚江水系中華鱉同工酶表達(dá)差異的研究尚未見報道。為了有效保護(hù)中華鱉的種質(zhì)資源,保持地方種群優(yōu)良的種質(zhì)性狀,應(yīng)用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法對姚江水系中華鱉6種不同組織中的乳酸脫氫酶(LDH)、酯酶(EST)、谷氨酸脫氫酶(GDH) 3種同工酶進(jìn)行了研究,并與日本品系中華鱉進(jìn)行比較,以期在蛋白質(zhì)水平上建立其種質(zhì)資源的遺傳標(biāo)記,為該地方品系中華鱉的種質(zhì)鑒定、遺傳分析及良種選育提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    試驗材料為三齡雄性中華鱉,其中姚江水系中華鱉取自浙江省余姚市明鳳淡水養(yǎng)殖場,日本品系中華鱉取自紹興中亞工貿(mào)園有限公司。

    1.2 樣品制備

    活鱉運(yùn)回實驗室后,迅速殺死取其心臟、肝臟、 腎臟、脾臟、肺和腿部肌肉,稱質(zhì)量后加入Tris-HCl緩沖液(pH值 75)進(jìn)行勻漿,再離心20 min,取其上清液與甘油按1 ∶2混合后,直接電泳或于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 電泳

    采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法[4-7],操作步驟參考區(qū)又君等報道的方法[5]進(jìn)行,電泳過程使用夾心式垂直板電泳槽(Mini-PROTEAN Tetra),取10 μL樣品加樣。分離膠濃度為7.5%(pH值8.8),濃縮膠濃度為4.5%(pH值6.8),電極緩沖系統(tǒng)為 Tris-Gly(pH值8.3),在160 V 恒壓、冰浴中電泳2 h(除EST研究的電泳時間為1.5 h外)。

    電泳后的凝膠染色參照何忠效等[6]和郭堯軍[7]的操作方法,并加以修改(表1)。在電泳結(jié)束前,提前配制好染色液,其中EST染色液需過濾后使用。電泳后的凝膠置于染色液中直至顯色,LDH、EST檢測凝膠室溫下約染色20 min,GDH檢測凝膠置于37 ℃染色約4 h。經(jīng)蒸餾水清洗染色后的顯色凝膠置于光亮背景下拍照記錄。

    2 結(jié)果與分析

    應(yīng)用于種群生化遺傳分析的同工酶譜,除酶帶應(yīng)清晰外,更重要的是反映出編碼該酶的幾個基因座位、存在幾個等位基因、是幾聚體的酶等特征性信息[8]。2個不同品系中華鱉的6種組織中3種同工酶活性強(qiáng)弱結(jié)果見表2。從表2中可以看出,2個品系中華鱉的心臟、肝臟、脾臟、腎臟中LDH、EST 2種同工酶均明顯表達(dá)且含量較高,肺與肌肉中的LDH、EST、GDH 同工酶有所表達(dá)但相比于其他組織的同工酶含量則較少。其中姚江水系中華鱉的6種組織中屬肝臟組織中同工酶的整體表達(dá)量最高,而日本品系中華鱉的6種組織中屬腎臟組織中同工酶的整體表達(dá)量最高。

    2.1 乳酸脫氫酶(LDH)

    2個品系中華鱉6種組織的LDH同工酶的電泳圖譜如圖1所示。姚江水系中華鱉LDH同工酶在心臟、肝臟、脾臟、腎臟中LDH-5含量最高,肌肉中LDH-1含量最高,肺中LDH-1、LDH-5的表達(dá)量均相對偏高,且在心臟、肝臟、腎臟、肌肉中有LDH-C基因(即LDH-6、LDH-7、LDH-8)表達(dá)。日本品系中華鱉LDH同工酶在心臟、脾臟、腎臟中LDH-5含量最高,肌肉中LDH-1含量最高,肺中LDH-1、LDH-5含量均相對偏高,且在心臟、肝臟、腎臟和肌肉中有LDH-C基因表達(dá)。姚江水系中華鱉相同組織LDH整體表達(dá)量與日本品系中華鱉類似,僅LDH-5在姚江水系中華鱉肝臟中表達(dá)高于日本中華鱉。

    2.2 酯酶(EST)

    中華鱉不同組織EST同工酶的電泳圖譜如圖2所示。由圖2可見,姚江水系中華鱉EST-1表達(dá)量高于日本品系中華鱉,日本品系中華鱉EST-4表達(dá)量遠(yuǎn)高于姚江水系中華鱉,姚江水系中華鱉的腎臟組織中EST-3表達(dá)量大于日本品系中華鱉。姚江水系中華鱉所有組織的EST-2、EST-3表達(dá)量都較高,EST-4表達(dá)量較低。姚江水系中華鱉的酯酶總活性依次為肝臟>腎臟>心臟>脾臟>肺>肌肉,尤其是EST-2、EST-3在肝臟、腎臟有顯示清晰的酶帶,在脾臟有微弱的酶帶。日本品系中華鱉所有組織的EST-2、EST-3表達(dá)量都較高,EST-1、EST-4表達(dá)量相當(dāng),其酯酶總活性依次為肝臟>腎臟>心臟>脾臟>肺>肌肉,尤其是 EST-2、EST-3在肝臟、腎臟組織電泳有清晰的酶帶。

    2.3 谷氨酸脫氫酶(GDH)

    GDH為二聚體酶,在不同品系中華鱉的不同組織的GDH酶譜中均呈現(xiàn)了3個活性區(qū)域(圖3)。姚江水系中華鱉的肝臟、心臟、腎臟、肌肉組織中GDH表達(dá)量較高,其他組織表達(dá)量低,且在肌肉中有GDH-1、GDH-3的表達(dá)。日本品系中華鱉在肝臟、脾臟、腎臟、肌肉中GDH表達(dá)量均較高,其中肝臟中的GDH表達(dá)量最高;GDH-1在肌肉中大量表達(dá)而在其他組織幾乎不表達(dá);肌肉中未檢測到GDH-2、GDH-3,而其他5種組織中都有所表達(dá)。日本鱉GDH表達(dá)量整體上高于姚江水系中華鱉,但肝臟和心臟組織中2個品系中華鱉的GDH表達(dá)量相近,肌肉組織中姚江水系中華鱉GDH-3的表達(dá)量高于日本中華鱉。

    3 結(jié)論與討論

    已有學(xué)者采用同工酶電泳分析了不同群體中華鱉的組織表達(dá)特異性[1-3,9-11]。如楊弘等采用垂直淀粉膠電泳對中華鱉腦、眼、心臟、肌肉、肝臟、腎臟和卵巢7種組織中的6種同工酶系統(tǒng)(LDH、ADH、IDH、ME、GAPDH、EST)進(jìn)行研究,構(gòu)建了中華鱉同工酶酶譜,揭示了LDH在中華鱉進(jìn)化上的保守性[2]。姚雁鴻等運(yùn)用垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對中華鱉和臺灣鱉的肝臟、腎臟、眼、肌肉等幾種組織中的LDH、EST同工酶進(jìn)行比較研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在中華鱉組織中有組織特異性、無多態(tài)性的LDH同工酶在臺灣鱉的組織中卻既有組織特異性又有多態(tài)性[3]。

    3.1 乳酸脫氫酶

    乳酸脫氫酶(LDH)是糖代謝途徑中一種重要的氧化還原酶,存在于機(jī)體所有組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi),能催化丙酮酸與乳酸之間的相互轉(zhuǎn)化,是研究最廣泛的一種同工酶[1-3,9-12]。已經(jīng)證明LDH同工酶系統(tǒng)具有明顯的種族及組織特異性[9,12]。心肌是含氧量豐富的組織,細(xì)胞以有氧代謝為主,催化乳酸生產(chǎn)丙酮酸的LDH-5占優(yōu)勢。骨骼肌是相對缺氧的組織,催化丙酮酸還原生產(chǎn)乳酸的LDH-1占優(yōu)勢,使骨骼肌因激烈運(yùn)動造成的相對缺氧條件下仍能得以酵解獲得能量[13]。

    中華鱉作為水陸兩棲的動物,能適應(yīng)較大的含氧量波動,既能適應(yīng)水環(huán)境,也能適應(yīng)短時間的陸上生活,故其肺部LDH-1、LDH-5都有較多表達(dá)。肝臟、腎臟、脾臟中LDH-5占優(yōu)勢的原因與心肌中LDH-5占優(yōu)勢的原因類似,且不同組織其他的酶帶均有所差異,推測LDH可作為姚江水系中華鱉組織特異性鑒定的同工酶。

    日本品系中華鱉和姚江品系中華鱉的心臟、肝臟、腎臟、肌肉組織都有LDH-C基因不同程度的表達(dá),其表達(dá)量與相應(yīng)組織在中華鱉體內(nèi)的活動度有一定的線性關(guān)系,推測LDH-C基因的表達(dá)可增加產(chǎn)能。此外,在姚江水系中華鱉的肝臟中LDH-5占優(yōu)勢,而在日本品系中華鱉中卻沒有出現(xiàn)該現(xiàn)象,這可能與日本中華鱉個體的脂肪含量較高有關(guān)(數(shù)據(jù)另文發(fā)表)。以上2個推測還有待進(jìn)一步研究驗證。

    3.2 酯酶

    酯酶(EST)是催化酯類化合物水解進(jìn)入中間代謝的重要水解酶,在細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行最基本的生理功能[10],其結(jié)構(gòu)多為單體,由1個亞基組成[4]。EST還能水解大量正常存在的非生理性酯類化合物,可能與機(jī)體的解毒功能有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),姚江水系中華鱉EST整體表達(dá)量低于日本鱉,猜測原因可能與中華鱉的生存環(huán)境有關(guān)。

    酯酶并非生理性修飾酶,故可以EST酶譜作為遺傳指標(biāo)[14-15]。從酶譜整體的角度看,姚江水系中華鱉和日本品系中華鱉的EST酶譜均呈現(xiàn)組織特異性。 酯酶EST-4在日本品系中華鱉中表達(dá)而在姚江水系中華鱉中基本不表達(dá),而姚江水系中華鱉腎臟中的酯酶EST-3表達(dá)量高于日本品系,且姚江水系中華鱉肝臟和腎臟中EST條帶數(shù)目多、活性強(qiáng),具有種屬特異性,均可作為姚江水系中華鱉的種屬鑒定指標(biāo)。

    3.3 谷氨酸脫氫酶

    谷氨酸脫氫酶(GDH)是動物體內(nèi)參與谷氨酸新陳代謝的關(guān)鍵酶之一[12-15],它以NAD、NADP或者同時利用兩者作為輔酶,參與到谷氨酸的合成與分解中,但在大多數(shù)生物體內(nèi)反應(yīng)是向著合成谷氨酸的方向進(jìn)行的[16]。目前水產(chǎn)動物同工酶GDH的研究少見報道。本研究發(fā)現(xiàn),GDH-3在日本品系中華鱉肌肉中不表達(dá),而在姚江水系中表達(dá),表明GDH-3的表達(dá)可能會導(dǎo)致某種生化途徑改變,從而影響生物的代謝途徑。由于谷氨酸是重要的鮮味氨基酸,故猜測GDH-3的高表達(dá)可能是姚江水系中華鱉與日本中華鱉相比味道更為鮮美的原因,但其相關(guān)性有待于進(jìn)一步確認(rèn)。GHD是氨基酸代謝中的重要酶類,尤其在非必需氨基酸的合成和轉(zhuǎn)化中起著重要作用[17];因此GDH-3的表達(dá)是否直接影響氨基酸含量也有待于進(jìn)一步研究。

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