區(qū)分高低致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT—PCR方法的建立

孫春亮　趙敬慧　劉月　蔡錦順

摘要：為了在臨床上快速、有效區(qū)分高低致病性PRRSV，參考GenBank發(fā)表的代表性毒株，根據(jù)高致病性毒株Nsp2基因上有30個氨基酸不連續(xù)缺失的特點，設(shè)計并合成1對引物，擴(kuò)增高低致病性PRRSV Nsp2基因的目的條帶長度分別為644、734 bp，從而將二者區(qū)分開來。用本方法對長春及其周邊地區(qū)送檢60份病料進(jìn)行盲檢，檢出10份高致病性PRRSV。并與N蛋白基因引物RT-PCR診斷方法進(jìn)行比較，結(jié)果均一致，表明該方法準(zhǔn)確性高。本研究所建立的RT-PCR方法為PRRSV在臨床上的快速診斷和實驗室流行病學(xué)調(diào)查提供了簡捷的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞：PRRSV；Nsp2基因；RT-PCR診斷；流行病學(xué)調(diào)查

中圖分類號： S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0226-02

2006年以來，中國南方部分地區(qū)豬場暴發(fā)高熱為特征的傳染性疾病，并逐漸蔓延擴(kuò)散到北方各地區(qū)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這種傳染性疾病后來被命名為豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），該病具有傳播速度快、發(fā)病率高、病死率高的特征，并且繼發(fā)感染鏈球菌等，與偽狂犬等病毒混合感染增加了臨床診斷的難度。因此，建立一種能夠快速，有效、準(zhǔn)確的檢測方法在 PRRS 的防控上具有重要意義。經(jīng)病原分離及分子流行病學(xué)分析，國內(nèi)流行的高致病性毒株主要是由1種帶有Nsp2基因部分缺失以及多個位點發(fā)生突變對豬呈高致病性的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）。

PRRSV基因組毒株間具有較高的遺傳變異性，M蛋白在各毒株間比較保守，同型毒株間M蛋白序列同源性大于96%，歐洲、美洲型毒株間序列同源性在78%～81%之間[1]；其次N蛋白保守性較高，歐洲、美洲型毒株間的同源性在59%～63%之間，同基因型毒株之間的同源性可達(dá) 96%～100%[2]。GP5、GP3、NSP2是容易發(fā)生變異的3個蛋白，其中GP5變異程度最大，歐洲、美洲型毒株間GP5同源性僅為52%～55%[3]其次為GP3，同一毒株間同源性為 86%～98%，2個基因型毒株間GP3氨基酸同源性為54%～ 60%，GP3多數(shù)變異發(fā)生在N末端，2個基因型GP3 N末端35個氨基酸殘基的一致性不到30%[4]。

在PRRSV基因組中非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2變異程度最顯著，美洲型同型毒株間同源性約為80%，美洲型、歐洲型毒株間同源性僅為 40% 左右，NSP2 的中心區(qū)易變異，并且變異不僅表現(xiàn)為個別堿基的置換，還表現(xiàn)在缺失和插入上。 Gao等對PRRSV分離株HB-2 （sh）/2002的全基因序列測定分析表明，NSP2蛋白存在編碼12個氨基酸的連續(xù)36個核苷酸的缺失，這是國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的NSP2蛋白存在缺失變異現(xiàn)象[5]。

本研究根據(jù) Nsp2基因序列設(shè)計引物，該引物包含 Nsp2基因缺失序列，分別對高致病和經(jīng)典毒株的基因片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，通過 RT-PCR 擴(kuò)增目的基因片段長度的不同可將二者區(qū)分開來。試驗結(jié)果表明，新建立的RT- PCR 鑒別方法可以達(dá)到快速、簡捷、有效區(qū)分高致病性變異 PRRSV與經(jīng)典型PRRSV的目的。

1 材料與方法

參考GenBank上多株P(guān)RRSV毒株序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計并合成1對引物，所設(shè)計這對引物覆蓋Nsp2基因整個缺失區(qū)域。由于高致病性PRRSV變異株與低致病株相比發(fā)生90個核苷酸的缺失，所以高致病性株和經(jīng)典株的預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別約644、734 bp。

上游引物：5′-CGAGCTTAAAGACCAGATGGAGGAG- 3′；下游引物：5′-CTTGAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT- 3′。

按照Simply P 總RNA提取試劑盒說明書，分別對PRRSV CC-13分離株RNA基因組進(jìn)行提取，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

臨床送檢樣品來源長春及周邊地區(qū)豬場疑似PRRS病死豬的組織病料（肺臟、脾臟、腎臟、子宮和淋巴結(jié)等），組織剪碎，在冰浴中勻漿，4 ℃靜置一段時間（0.5～1.0 h），10 000 r/min 離心10 min取上清，提取RNA。取病料上清液100 μL到滅菌1.5mL離心管中，按照RNA提取試劑盒說明書提取病料RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制備cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

將PRRSV （CC-13株）、PCV2、CSFV、PRV病毒用合成的F/R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

用Marc-145細(xì)胞對PRRSV（CC-13株）進(jìn)行病毒效價滴定，計算病毒TCID50，經(jīng)測定病毒效價為105 TCID50/0.1 mL。然后依次稀釋成10 000、1 000、100、10、1、0.1、0.01 TCID50，提取病毒RNA并制備cDNA，用建立的RT-PCR方法進(jìn)行檢測。

對上述的敏感性和特異性試驗重復(fù)3次，以檢驗該方法的重復(fù)性情況。用建立的RT-PCR方法檢測臨床送檢樣品，鑒定結(jié)果與N蛋白基因引物RT-PCR鑒定結(jié)果進(jìn)行對比。

2 結(jié)果與分析

對PRRSV CC-13株、PCV2、CSFV、PRV進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果只有PRRSV CC-13株出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果擴(kuò)增出644 bp的目的片段，說明本方法特異性較好。根據(jù)擴(kuò)增片段大小判斷可知PRRSV CC-13株為高致病性PRRSV變異株，結(jié)果見圖1。自1996年首次確定PRRSV在中國存在以來，針對PRRSV建立了很多種檢測方法，主要包括普通RT-PCR、熒光定量RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)RT-LAMP、ELISA、膠體金、免疫熒光試驗等。其中就有高靈敏度的檢測方法如熒光定量RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)等，但這些檢測方法價格高，操作技術(shù)要求嚴(yán)，不適合用于普通臨床檢測。ELISA、膠體金等檢測方法操作容易，但檢測靈敏度與重復(fù)性又受到質(zhì)疑。簡單、快速、準(zhǔn)確的RT-PCR檢測方法成為目前診斷的主要方法。

經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳觀察，在0.01 TCID50處仍可看到特異性條帶，結(jié)果表明，本方法敏感度可達(dá)0.1 TCID50（圖2）。本方法具有很好的特異性，可以實現(xiàn)PRRSV的特異性擴(kuò)增；敏感性試驗表明，該方法檢測的敏感度可達(dá) 0.1 TCID50，表明本方法的敏感性較高，可以較敏感地檢測到樣品中的PRRSV。重復(fù)性試驗表明，重復(fù)3次檢測結(jié)果基本一致，說明本方法的重復(fù)性較好。

對上述的敏感性和特異性試驗重復(fù)3次，陽性情況以及擴(kuò)增條帶大小情況與上述結(jié)果一致。

用本試驗建立的RT-PCR方法，對長春及周邊送檢的60份病料進(jìn)行盲檢，結(jié)果有10份病料為陽性，與研究中用針對N蛋白基因的引物進(jìn)行RT-PCR檢測結(jié)果相一致。從圖3可看出，上述部分樣品中分別位于5、9、11的3個樣品的擴(kuò)增片段約為644 bp片段，與圖4中N蛋白基因引物鑒定結(jié)果基本一致，并且可以判斷出這3個陽性樣品為高致病性PRRSV毒株。本試驗所建立的RT-PCR鑒別診斷方法，它不僅能夠為流行病學(xué)研究提供輔助手段和方法，而且還能夠為流行病學(xué)研究指引方向，在辨明毒株的類型前提下，可以有的放矢地開展相關(guān)研究。

3 結(jié)論

建立一種快速、準(zhǔn)確區(qū)分高致病性PRRSV與低致病性PRRSV的RT-PCR方法，通過驗證該方法可以應(yīng)用于臨床診斷，快速鑒別出高低致病性PRRSV毒株。

參考文獻(xiàn)：

[1]Meng X J，Paul P S，Halbur P G，et al. Phylogenetic analyses of the putative M （ORF 6） and N （ORF 7） genes of porcine reproductive and respiratorysyndromevirus（PRRSV）：implicationfortheexistence of two genotypes of PRRSV in the U.S.A. and Europe[J]. Archives of Virology，1995，140（4）：745-755.

[2]Magar R，Larochelle R，Dea S，et al. Antigenic comparison of Canadian and US isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus using monoclonal antibodies to the nucleocapsid protein[J]. Canadian Journal of Veterinary Research-Revue Canadienne de Recherche Veterinaire，1995，59（3）：232-234.

[3]Suárez P，Zardoya R，Martín M J，et al. Phylogenetic relationships of European strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） inferred from DNA sequences of putative ORF-5 and ORF-7 genes[J]. Virus Research，1996，42（1/2）：159-165.

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