牡丹皮中多糖提取工藝的響應(yīng)曲面法優(yōu)化研究

張利霞+常青山+侯小改+侯典云+薛俊鵬+徐凱鋒+李亞鴿

摘 要：

為高效提取中藥材牡丹皮中的多糖，利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化回流提取牡丹皮多糖工藝。在單因素試驗基礎(chǔ)上，以提取溫度、提取時間、水料比為響應(yīng)因子，采用Box-Behnken design方法進行三因子三水平試驗，以多糖得率為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析。結(jié)果表明：提取溫度與提取時間均顯著影響牡丹皮多糖提取得率，三因子對多糖提取得率的影響作用大小依次為：提取溫度﹥提取時間﹥水料比。牡丹皮多糖提取的最佳工藝條件為提取溫度84℃、提取時間1.1 h、水料比31∶1，牡丹皮多糖提取得率預(yù)測值為3.732%，驗證后得率為3.727%，與預(yù)測值基本吻合，相對誤差為0.134%。本研究為牡丹皮的精深加工提供理論依據(jù)，同時為牡丹皮多糖構(gòu)效關(guān)系的深入研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：牡丹皮;多糖;響應(yīng)面分析;優(yōu)化

中圖分類號：S567.1+5 ?文獻標識號：A ?文章編號：1001-4942（2015）06-0118-07

Optimization of Extraction Technology of Polysaccharides

from Moutan Cortex via Response Surface Methodology

Zhang Lixia1， Chang Qingshan2*， Hou Xiaogai1， Hou Dianyun1，Xue Junpeng1， Xu Kaifeng1， Li Yage1

（1. College of Agriculture， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China;

2. College of Forestry， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China）

Abstract To efficiently extract polysaccharides from moutan cortex， the response surface methodology was used to optimize the extraction technology. The Box-Behnken design method was used to conduct the 3-factors and 3-levels experiment on the basis of single-factor experiment for the responsive surface analysis. The extraction temperature， extraction time and ratio of water to material were the response factors. The yield of polysaccharides was the response value. The results showed that the yield of polysaccharides were significantly affected by extraction temperature and time. The effects of the 3 factors on polysaccharide yield were in order of extraction temperature，extraction time and ratio of water to material. The optimum extraction conditions were the extraction temperature as 84℃， extraction time of 1.1 hours and ratio of water to material as 31∶1. The predicted value of polysaccharide yield was 3.732% and the verified value was 3.727%. The verified value was basically coincident with the predicted one with the relative error as 0.134%. This study could provide theoretical references for deep processing of moutan cortex and lay the foundation for studying on the structure-function relationship of polysaccharides from moutan cortex.

Key words Moutan cortex; Polysaccharide; Responsive surface analysis; Optimization

牡丹皮為芍藥科芍藥屬多年生植物牡丹 （Paeonia suffruticosa Andrews）的干燥根皮，是我國傳統(tǒng)中藥材，中醫(yī)臨床應(yīng)用歷史悠久[1]。牡丹皮始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，其性微寒，味苦、辛，具有清熱涼血、活血化瘀的功效，用于治療熱入營血，溫毒發(fā)斑，夜熱早涼，吐血衄血，無汗骨蒸，跌撲傷痛，癰腫瘡毒，經(jīng)閉痛經(jīng)等癥[2]。牡丹皮的有效成分主要為酚及酚苷類、甾醇及其苷類、萜類及其苷類、多糖、黃酮、有機酸、香豆素等;藥理實驗表明，牡丹皮具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、調(diào)節(jié)免疫功能、保肝、消炎、抗菌等藥理作用。endprint

近年來，植物多糖一直是功能性成分中的研究熱點，多糖類物質(zhì)與維持人體機能的細胞活動關(guān)系密切，其作為免疫制劑具有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)：植物多糖具有抑制腫瘤[3]、增強免疫[4，5]、抗衰老[6]、抗氧化[7]、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)[8，9]等重要藥理作用。近年來牡丹皮多糖的研究日益被重視，彭代銀等[10]通過藥理實驗發(fā)現(xiàn)牡丹皮多糖具有很高的安全性;萬京華等[11]認為牡丹皮多糖對免疫抑制小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用;趙幟平等[12]認為丹皮多糖具有降低小鼠血糖作用;杜凡等[13]認為牡丹皮中多糖單用或與丹皮酚、總苷合用均有抑菌作用，牡丹皮多糖開發(fā)成新藥的利用前景廣闊。

影響牡丹皮水溶性多糖提取得率的因素有很多，如提取時間、提取溫度、水料比等，但一個因素的影響作用決定于其它因素，若在一定時間內(nèi)只考慮單個因素的影響作用不僅嚴重耗時，而且無法檢測不同因素間的交互作用[14]。響應(yīng)曲面法（response surface methodology，RSM）是一種被廣泛使用的優(yōu)化實驗條件的統(tǒng)計模型，可以有效減少實驗次數(shù)、檢測不同因素之間的交互作用，并能尋求因素的最佳操作條件[14，15]。本研究以提取溫度、提取時間和水料比作為響應(yīng)因子，以牡丹皮多糖得率為考察指標，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法（RSM）技術(shù)中的Box-Behnken design方法，優(yōu)化牡丹皮中多糖提取工藝，建立并驗證相關(guān)數(shù)學(xué)模型，旨在為科學(xué)合理利用牡丹皮多糖資源及牡丹皮多糖構(gòu)效關(guān)系的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

牡丹皮中藥材購自洛陽市澗西區(qū)健康大藥房，經(jīng)鑒定為芍藥科芍藥屬植物牡丹（P. suffruticosa）的干燥根皮飲片。

試劑：乙醚、丙酮、無水乙醇、乙酸乙酯、硫酸、葡萄糖、蒽酮等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

Q-250A3高速多功能粉碎機（上海冰都電器有限公司），HH-W600數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市科析儀器有限公司），H1850R高速冷凍離心機（湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司），F(xiàn)A1204B精密天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），752S紫外可見分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司），GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 葡萄糖標準曲線的制備 精確稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖37.5 mg，置于250 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，配得葡萄糖對照品溶液。精確吸取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，分別加入蒸餾水至 2.0 mL，然后分別再加入2%蒽酮-乙酸乙酯溶液0.5 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，立即置于沸水浴中，準確計時15 min后取出，用冷水冷卻至室溫，靜置10 min，同時以蒸餾水2.0 mL加 2%蒽酮-乙酸乙酯溶液0.5 mL和濃硫酸5.0 mL作空白，在（624 ±1） nm波長處測定吸光值。以糖含量（μg）為橫坐標、吸光度為縱坐標，制得標準曲線：y = 0.0068x - 0.0282，r = 0.9997，糖含量在0.015 ～ 0.105 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.2 牡丹皮多糖的提取與含量測定 將牡丹皮飲片在60℃下鼓風干燥至質(zhì)量恒定，粉碎，過60目篩，稱取約0.5000 g的牡丹皮粉末，置于250 mL燒瓶中，加入乙醚用索氏提取器提取2 h進行脫脂處理。然后揮去溶劑，再加入80%乙醇50 mL，在60℃下回流提取1.0 h進一步除雜，過濾后將殘渣用80%乙醇10 mL洗滌2次，再用丙酮洗滌2次，然后改用蒸餾水提取，控制一定條件回流一定時間后在10 000 r/min下離心10 min，共離心3次，將上清液合并，全部置于250 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，待測。

精密吸取該試液1 mL，加入蒸餾水1 mL，然后分別再加入2%蒽酮-乙酸乙酯溶液0.5 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，立即置于沸水浴中，準確計時15 min后取出，用冷水冷卻至室溫，靜置10 min，同時以2.0 mL蒸餾水加 2%蒽酮-乙酸乙酯溶液0.5 mL和濃硫酸5.0 mL作空白，在（624 ±1） nm波長處測定樣品吸光度，計算粗多糖提取得率。

粗多糖提取得率（%）= 糖溶液中多糖的質(zhì)量/牡丹皮粉末的質(zhì)量 × 100

1.3.3 牡丹皮多糖回流提取工藝的單因素試驗 本研究以提取溫度、提取時間和水料比為因素，牡丹皮多糖提取得率為指標進行單因素試驗。單因素提取溫度：60、70、80、90、100℃;提取時間：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h;水料比：10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1。

在進行單因素提取試驗時，除考察因素梯度設(shè)置外，其它兩個因素均設(shè)定為中間值，即不同溫度提取時，時間和水料比分別設(shè)置為1.5 h與30∶1;不同時間和水料比提取時，溫度設(shè)置為80℃。每個因素每個水平提取3次，取平均值。

單因素提取測定之后，以多糖提取得率為縱坐標，相應(yīng)考察因素為橫坐標，作圖。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定每個因素最佳水平，用于響應(yīng)面設(shè)計交叉試驗。

1.3.4 牡丹皮多糖回流提取工藝響應(yīng)面試驗優(yōu)化設(shè)計與數(shù)據(jù)分析方法 在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken design試驗設(shè)計原理，選取影響牡丹皮多糖提取得率（Y）的3個影響因素：提取溫度（X1）、提取時間（X2）、水料比（X3）三因素作為自變量進行組合。自變量水平以-1、0、1來代表，xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，具體試驗因素及水平編碼見表1，試驗設(shè)計組合及結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素水平及編碼

因素代碼編碼值真實值水平-101endprint

提取溫度（℃）x1X1708090

提取時間（h）x2X20.51.01.5

水料比（mL/g）x3X3203040

利用Design-Expert 8.0軟件對牡丹皮多糖提取結(jié)果進行回歸分析，擬合二次多項式模型方程。根據(jù)R2值可以判斷多項式模型方程擬合的可靠性，R2值越接近于1，多項式模型方程與實際擬合的可靠性就越高。F值檢驗?zāi)Ｐ徒y(tǒng)計學(xué)顯著性，F(xiàn)值越大說明該自變量對因變量的影響作用越顯著;模型系數(shù)的概率P值檢驗因素的線性效應(yīng)、平方效應(yīng)及其交互效應(yīng)的顯著性，P值越小，則相應(yīng)自變量的顯著性越高，P<0.05時影響顯著，P<0.01時影響極顯著[16]。

表2 多糖提取工藝條件的優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果

實驗號x1x2x3多糖得率 （%）

1-1-102.192

21-103.250

3-1102.353

41103.328

5-10-12.285

610-13.039

7-1011.825

81013.389

90-1-13.237

1001-13.382

110-113.191

120113.216

130003.626

140003.580

150003.597

160003.684

170003.645

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對牡丹皮多糖得率影響研究

2.1.1 提取溫度對牡丹皮多糖得率的影響 設(shè)定提取時間為1.0 h、水料比為30∶1條件下，以提取溫度對牡丹皮多糖提取得率進行單因素試驗。從圖1可以看出，在溫度低于80℃時，多糖提取得率隨著溫度的升高而逐漸增加，且增幅明顯，在80℃時達到最大值，之后逐漸下降。這種現(xiàn)象可能是由于溫度過高使牡丹皮多糖的結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致提取得率下降。因此，提取溫度選擇在80℃左右為宜。

圖1 提取溫度對多糖得率的影響

2.1.2 ?提取時間對牡丹皮多糖得率的影響 設(shè)定提取溫度為80℃、水料比為30∶1條件下，以提取時間對牡丹皮多糖得率進行單因素試驗。從圖2可以看出，牡丹皮多糖提取得率隨著時間的延長呈先上升后下降的趨勢，在1.0 h達到最大值。由此說明，利用回流方法提取牡丹皮多糖時，時間不宜過久，否則多糖結(jié)構(gòu)亦會遭到破壞，從而使多糖得率降低。因此，提取時間選擇在1.0 h左右為宜。

圖2 提取時間對多糖得率的影響

2.1.3 水料比對牡丹皮多糖得率的影響 ?設(shè)定提取溫度為80℃、提取時間為1.0 h條件下，以水料比對牡丹皮多糖提取得率進行單因素試驗。從圖3結(jié)果可以看出，在水料比小于30∶1時，多糖得率增加趨勢明顯，在水料比為30∶1時，多糖得率達到最大值，之后呈緩慢下降趨勢。因此，選擇水料比在30∶1左右為宜。

圖3 水料比對多糖得率的影響

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化牡丹皮多糖提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析結(jié)果 通過Design-Expert 8.0 軟件對各因素進行回歸擬合，得到以下多元二次回歸方程：多糖得率Y（%）=-46.08910+1.17185X1+1.50510X2-5.21139×10-3X3-4.12000×10-3X1+2.02574×10-3X1X3-6.01831×10-3X2X3-7.33820×10-3X12-0.44621X22-2.58071×10-3X32

對牡丹皮多糖提取工藝進行響應(yīng)面分析，結(jié)果（表3、表4）表明，模型的F值為221.20，且模型顯著性檢驗P<0.01，表明該模型是極顯著的，具有統(tǒng)計學(xué)意義。失擬值為2.40，失擬項P值為0.2080>0.05，表明失擬和純誤差相關(guān)不顯著，無失擬因素存在。模型的決定系數(shù)R2=0.9965，校正決定系數(shù)R2（adj） = 0.9920 > 0.80，變異系數(shù)（CV）為1.665%，說明該模型擬合度較好，響應(yīng)值（多糖提取得率）的變化有99.65%來自于所選的變量，即提取溫度、提取時間和水料比。進一步說明得到的牡丹皮多糖提取得率二次回歸模型對實際擬合情況較好，可用該回歸方程對牡丹皮多糖提取工藝研究進行初步分析和預(yù)測。

由表4可知，模型的自變量一次項X1，二次項X1X3、X1X1、X2X2、X3X3達極顯著水平（P<0.01）;一次項X2呈顯著水平（P<0.05）。同時，根據(jù)F值的大小順序，可以推斷在選擇的實驗范圍內(nèi)，三個因素對多糖提取得率的影響作用不同，作用大小排序為：提取溫度（X1）>提取時間（X2）>水料比（X3），其中提取溫度對牡丹皮多糖提取得率的影響作用達到極顯著水平（P<0.01），提取時間對牡丹皮多糖提取得率的影響作用達到顯著水平（P<0.05），而水料比的影響作用不顯著（P>0.05）。

表3 多糖提取擬合多元二次模型差異分析

標準偏差平均值變異系數(shù)

（%）決定系數(shù)校正決定

系數(shù)預(yù)測決定

系數(shù)信噪比

0.0523.1071.6650.99650.99200.962044.830

表4 方差分析結(jié)果

方差來源 平方和自由度均方 MSF值 P值（Prob >F）顯著性

模型5.3300 90.5900 221.20 < 0.0001**

X12.3700 12.3700 884.40 < 0.0001**endprint

X2 0.0210 10.0210 7.81 0.0267*

X30.0130 10.0130 4.84 0.0637

X1X20.0017 10.0017 0.64 0.4488

X1X3 0.1600 10.1600 61.30 0.0001**

X2X30.0036 10.0036 1.35 0.2841

X1X12.2700 12.2700 847.39 < 0.0001**

X2X20.0530 10.0530 19.68 0.0030 **

X3X30.2800 10.2800 104.81 < 0.0001**

殘差0.0190 70.0027 --

失擬0.0120 30.0040 2.40 0.2080

純誤差0.0067 40.0017 --

總差5.3500 16---

注：**表示差異極顯著（P<0.01），*表示差異顯著（P<0.05）。

2.2.2 因素間的交互影響 根據(jù)回歸方程得到牡丹皮多糖提取不同因素的響應(yīng)面分析三維圖及相應(yīng)等高線圖（圖4～圖6），可清晰、直觀地看出響應(yīng)曲面的最高點，參數(shù)范圍內(nèi)的極值與不同因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響作用，據(jù)此能夠確定最佳工藝條件范圍。

圖4 Y=f（X1，X2）的三維響應(yīng)圖與等高線圖

圖5 Y=f（X1，X3）的三維響應(yīng)圖與等高線圖

圖6 Y=f（X2，X3）的三維響應(yīng)圖與等高線圖

圖4為水料比為30∶1時不同提取溫度和提取時間對牡丹皮多糖提取得率的影響，從圖中可知，提取溫度在85℃左右，提取時間在1.0 h左右，牡丹皮多糖提取得率達到最大值。圖5為提取時間為1.0 h時不同提取溫度和水料比對牡丹皮多糖提取得率的影響，從圖中可知，提取溫度在80℃左右，水料比為30 mL/g左右，牡丹皮多糖提取得率達到最大值。圖6為提取溫度為80℃時，不同提取時間與水料比對牡丹皮多糖提取得率的影響，從圖中可以看出提取時間在1.0 h左右，水料比在30 mL/g左右，牡丹皮多糖提取得率達到最大值。

對多元二次回歸模型（1）求解方程，提取牡丹皮多糖的最佳工藝條件為提取溫度83.77℃、提取時間1.09 h、水料比30.60∶1，由擬合模型預(yù)測牡丹皮多糖最大提取得率為3.732%。為達到提高效率與節(jié)省能耗并取得最佳效果的目的，同時考慮到實際操作的可行性，將牡丹皮多糖的提取工藝條件修正為：提取溫度84℃、提取時間1.1 h、水料比31∶1。

采用上述最佳工藝提取牡丹皮多糖（n = 4）以驗證響應(yīng)面的可行性。結(jié)果顯示，實際平均提取得率為3.727%，與理論預(yù)測值3.732%基本吻合，比單因素平均提取率高22.82%。

3 討論

多糖是構(gòu)成生命的天然大分子之一，是由單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子聚合物，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類多樣，在提取時若溫度過高或提取時間過長，多糖易發(fā)生分解或結(jié)構(gòu)受到破壞。本研究在單因素試驗中，提取溫度在達到80℃、提取時間達到1.0 h之后，牡丹皮多糖提取得率均出現(xiàn)下降趨勢，尤其是溫度達到90℃之后，多糖提取得率迅速下降，說明高溫可能會影響牡丹皮多糖的結(jié)構(gòu)和活性，使其發(fā)生分解，這與房海靈等[17]研究結(jié)果一致。在熱回流提取牡丹皮多糖的過程中，提取溫度是影響多糖提取得率的最關(guān)鍵因素。孟憲軍等[18]研究發(fā)現(xiàn)提取五味子多糖最優(yōu)提取時間為5 h，Shao等[19]研究發(fā)現(xiàn)提取三葉青根中多糖最優(yōu)提取時間為1.55 h，而本研究中提取牡丹皮多糖最優(yōu)提取時間為1.1 h，比文獻報道的提取時間較短，這可能與植物材料種類、多糖構(gòu)成及其含量多少有關(guān)，植物器官中多糖含量越高，相應(yīng)的提取時間可能會被延長。

植物多糖的提取方法有多種，例如：溶劑提取法、酶提法、超聲提取法、微波提取法等，但不同方法各有優(yōu)劣，溶劑提取法作為常用方法之一，具有成本低、不需特殊設(shè)備等優(yōu)點，在實際生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛。Shao等[19]利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取三葉青根中多糖，測得多糖提取得率為5.182%;于愛紅[20]利用正交試驗優(yōu)化毛茛科植物大火草根多糖熱回流提取工藝，多糖提取得率為5.916%;劉玉芬等[21]利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化馬蘭頭多糖提取工藝，在最佳提取條件下測得馬蘭頭不同部位多糖含量，葉為4.941%，莖為1.536%，根為0.682%，為其植物資源的有效開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。研究表明，不同產(chǎn)地、采收期、加工方法等因素均會影響丹皮多糖得率，因此，若以多糖含量與多糖提取得率共為指標來衡量試驗結(jié)果，則能更加準確、全面地考查相關(guān)試驗因素的影響作用[22]。4 結(jié)論

響應(yīng)曲面法可應(yīng)用于優(yōu)化牡丹皮多糖提取工藝。本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken method對牡丹皮多糖提取工藝進行優(yōu)化，并根據(jù)統(tǒng)計學(xué)結(jié)果對模型進行顯著性檢驗，探討各因素間的交互作用，優(yōu)化內(nèi)在單因素水平，并對試驗結(jié)果進行模擬、預(yù)測，最終以最經(jīng)濟的方式準確、高效地得到優(yōu)化條件。

通過回歸模型及方程優(yōu)化得到牡丹皮多糖提取的最佳條件為：提取溫度84℃，提取時間1.1 h，水料比為31∶1，此條件下牡丹皮多糖平均提取得率為3.727%。回歸分析與驗證試驗結(jié)果表明，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化牡丹皮多糖的提取工藝條件，得到的多糖提取工藝流程能夠提高效率并使多糖得率最大化。該研究結(jié)果對于牡丹皮多糖構(gòu)效關(guān)系的研究具有重要意義，為牡丹皮多糖的精深加工和新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)，具有一定的理論和實際應(yīng)用價值。

參 考 文 獻：

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