五味子粉末飲片顆粒度適宜性研究*

★ 陸曉暉＊＊ 唐芳瑞 馬志林 邵 峰 黃慧蓮 劉榮華＊＊＊ (.佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院 廣東佛山5800;.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌0004;.江西匯仁集團(tuán)有限公司 南昌005)

北五味子為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實，具有補腎養(yǎng)心、收斂固澀、補益生津、強壯等功效，臨床上用于治療久瀉不止、遺尿尿頻、夢遺滑精、心悸失眠、自汗盜汗等癥狀［1－3］，現(xiàn)代藥理研究表明，以五味子醇甲、五味子甲素為代表的木質(zhì)素類成分具有顯著的保護(hù)肝細(xì)胞、改善肝功能［4］，抑制宮頸癌細(xì)胞生長［5］，抗腦缺血性損傷［6］、抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷［7］、抗癲癇［8］、抗氧自由基和中樞神經(jīng)抑制作用等活性［2］。雖有文獻(xiàn)報道［9］，不同粒度五味子飲片中五味子醇甲等6種木脂素成分含量存在明顯差異，但僅局限與6種木脂素成分的含量變化上，對于不同粉碎度五味子粉末飲片的適宜性研究未見報道。本文將醋制五味子分級處理為不同粉碎度的粉末飲片，采用HPLC法同時測定其五味子醇甲和五味子甲素的提取率和進(jìn)行HPLC指紋圖譜的對比分析研究，采用干燥減重法測定比較總浸出物的含量變化，探討五味子飲片進(jìn)行粉末化處理分級后其質(zhì)量的差異性，從而為五味子飲片的高效臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高速中藥粉碎機(YF－103，浙江省瑞安市永歷制藥機械有限公司，功率0.8kw，轉(zhuǎn)速25000r/min);十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司);中國藥典專用篩(1－9號篩，浙江省上虞市華康化驗儀器廠);Waters－2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，2996型二極管陣列檢測器和Empower工作站;Aglient1200高效液相色譜儀，Agilent ChemStation工作站以及 VWD檢測器(美國Aglient公司)。

1.2 試藥 五味子醇甲對照品(含量測定用，批號110857－200102)、五味子甲素對照品(含量測定用，批號110764－200107)均購于中國藥品生物制品檢定所;甲醇(色譜純，Dikmapure，DIMA TECHNOLOGY Inc.);甲醇(分析純，上海振興化工一廠);實驗用水為雙蒸水，自制。

1.3 藥材收集與前處理 傳統(tǒng)炮制醋制五味子飲片(購自江中中藥飲片有限公司)，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)劉榮華教授鑒定為正品，憑證標(biāo)本存于江西中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館。

按照《中國藥典》2010年版(一部)ⅡA“藥材取樣法”分別取五味子藥材干燥品若干克，經(jīng)粉碎機粉碎后，分別通過藥典篩1－9號，制備成10個同一批次藥材的不同顆粒度粉末飲片樣品，編號依次為0－9號，備用，見表1。

表1 樣品分級處理過程

2 五味子醇甲、五味子甲素的提取率測定

2.1 HPLC色譜條件 Aglient1200 HPLC色譜儀，四元泵，真空脫氣機，色譜柱:Aglient ZORBAX E-clipse XDB －C18Analytical 4.6mm ×250mm，5μm;流動相:乙腈(A)－0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～12min，45% ～100%A;12～20min，100%A;20～25min，100% ～45%A);柱溫:25℃;檢測波長:225nm;進(jìn)樣量:10μL，流速:1.0mL/min。

2.2 供試品及對照品溶液的制備 根據(jù)常規(guī)飲片服用方式進(jìn)行模擬，分別取各樣品2.0g，以飲片質(zhì)量:蒸餾水體積=1∶15，置于50mL圓底燒瓶中，加入30mL蒸餾水，稱重，以沸水浴進(jìn)行回流提取，提取時間30min，趁熱過濾，放冷，加水補足重量，靜置，取濾液1mL，以1∶1甲醇稀釋定容至2mL，充分搖勻，吸取甲醇稀釋液若干，通過0.45μm有機系濾頭，得樣品制備液，備用。

精密稱取五味子醇甲對照品5.15mg、五味子甲素對照品4.37mg，同時置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配成含五味子醇甲濃度為0.515 mg/mL，五味子甲素為 0.437mg/mL 的儲備液。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實驗 分別精密吸取空白對照溶液、混合對照品溶液、供試品溶液各10μL，按“2.1項”下色譜條件依次注入高效液相色譜儀中，采用外標(biāo)法測定含量，在上述條件下，得到色譜峰理論塔板數(shù)不低于6000，分離度均大于1.5。圖中1號為五味子醇甲，2號為五味子甲素，結(jié)果見圖1。

2.4 方法學(xué)考察

圖1 混合對照品溶液(A)、五味子粉末飲片樣品溶液(B)的HPLC色譜圖

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取對照品儲備液分別稀釋成含五味子醇甲和五味子甲素一系列濃度:五味子醇甲濃度分別為0.025 76，0.032 20，0.064 40，0.128 800，0.257 60 mg/mL;五味子甲素濃度分別為 0.005 47，0.002 735，0.001 368，0.000 5295，0.000 2735mg/mL。分別取上述溶液10μL進(jìn)樣，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對照品溶液質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，作線性回歸方程。得五味子醇甲的回歸方程為 Y=4.1588×104X－62.294，線性范圍為:0.258μg ～ 2.580 μg(r=0.9993);五味子甲素的回歸方程為 Y=4.1982×104X+8.8187，線性范圍為 0.002 74μg～0.0547μg(r=0.9995)。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜峰面積，五味子醇甲和五味子甲素的峰面積RSD值分別為0.46%，0.34%。表明該儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 精密稱取7號樣品5份，各2.0g，按“2.2”項下供試品處理方法制備，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行分析，計算得五味子醇甲和五味子甲素的峰面積RSD值分別為0.62%、0.37%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取1號樣品，按“2.2”項下方法制備得供試品溶液，在室溫下放置，分別在0，3，6，9，12，24h 進(jìn)行測定，記錄色譜峰面積，并計算得到五味子醇甲和五味子甲素的峰面積RSD值分別為1.09%，1.28%。表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.4.5 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的1號五味子粉末飲片5份，各1.0g，分別精密加入一定量的對照品，按“2.2”項下供試品溶液處理方法制備，按“2.1”項色譜條件進(jìn)行色譜分析，由測得量與加入量計算回收率，結(jié)果見表2。由以下結(jié)果表明，五味子醇甲與五味子甲素的回收率符合實驗要求，表明本實驗方法的準(zhǔn)確定良好。

表2 五味子醇甲和五味子甲素加樣回收率(n=5)

2.5 實驗結(jié)果 根據(jù)上述方法測定了10種五味子粉末飲片五味子醇甲與五味子甲素的提取率，結(jié)果見表3。

表3 五味子醇甲與五味子甲素的提取率結(jié)果(n=10)mg/g

3 五味子粉末飲片浸出物的測定

3.1 實驗方法 分 別精密稱定各五味子粉末飲片10.0g，平行測定10次，以飲片質(zhì)量:蒸餾水體積=1:15，置于500mL圓底燒瓶中，加入150mL蒸餾水，以沸水浴回流提取30min，趁熱過濾，放冷，水浴蒸發(fā)，減壓干燥至恒重，采用減重法進(jìn)行稱定。

3.2 實驗結(jié)果 見 表4。

4 HPLC指紋圖譜的測定與分析

4.1 樣品前處理 分 別精密稱取五味子各組飲片各 1 .0g，以飲片質(zhì)量:蒸餾水體積 = 1∶15，按照“2.2”項下制備供試品溶液的方法處理，得樣品制備液，備用。

4.2 HPLC色譜條件 W aters－2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，2996型二極管陣列檢測器和Empower工作站;色譜柱:Aglient ZORBAX E-clipse XDB －C18Analytical 4.6mm ×250mm，5μm;流動相:乙腈(A)－0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～20min，5% ～25%A;20 ～50min，25% ～80%A;50～60min，80%A)，柱溫:25℃，檢測波長:252nm，進(jìn)樣量:10μL，流速:1.0 mL/min。

表4 五味子粉末飲片水提取浸膏得率(n=10)

4.3 結(jié)果

4.3.1 指紋圖譜 按實驗分析方法測定10種五味子粉末飲片的HPLC色譜指紋圖譜疊加圖如圖2:

4.3.2 共有指紋峰的標(biāo)定 利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 A版”軟件，以醋制五味子原飲片(0號)為參照峰生成五味子粉末飲片共有模式的對照指紋圖譜。以5號峰為參照峰(S)，其保留時間為1，各共有峰的相對保留時間如表5所示，結(jié)果表明RSD值小于3%，符合指紋圖譜的要求。見圖3。

4.3.3 共有指紋峰相對峰面積 根據(jù)五味子粉末飲片供試品HPLC指紋圖譜測定結(jié)果，以5號峰為參照峰(S)，以其峰面積為1，計算其他各共有指紋峰的相對峰面積，結(jié)果見表6。

圖3 五味子顆粒化飲對照指紋圖譜共有峰的標(biāo)定

4.3.4 非共有峰面積 通過對五味子樣品的HPLC指紋圖譜結(jié)果測定，統(tǒng)計各組飲片非共有峰面積占總峰面積比值，其共有峰面積百分比在43.44% ～53.19%，結(jié)果見表7。

表5 五味子粉末飲片HPLC指紋譜圖的共有峰相對保留時間

表6 五味子粉末飲片指紋圖譜共有峰的相對峰面積

表7 五味子粉末飲片指紋圖譜總峰面積、共有峰面積、非共有峰面積

5 討論

五味子粉末粗細(xì)對五味子醇甲與五味子甲素的溶出呈現(xiàn)一定規(guī)律性變化，隨著粉碎度由粗到細(xì)，兩者的提取率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，五味子粉末飲片在50～65目范圍內(nèi)五味子醇甲的溶出達(dá)最大值(4.47mg/g)，是原飲片的3.5倍多，是200目以上細(xì)粉樣品的1.64倍;而五味子甲素的溶出在65～80目范圍內(nèi)出現(xiàn)最大值(0.098mg/g)，是原飲片的3.5倍，是200目以上細(xì)粉樣品的4.67倍，充分表明五味子粉碎處理的確對有效成分的溶出具有相當(dāng)大的影響。粉碎度在50～80目之間時，有利于兩種主要有效成分溶出。

五味子粉末飲片浸出物利率最高是在65～80目粉碎度范圍內(nèi)，浸出率達(dá)到9.85%，是原飲片浸出率的 1.4倍，其次是 50～65目，浸出率達(dá)到9.59%。65～80目以上時，隨著顆粒細(xì)度的增加，浸出率出現(xiàn)相對小幅度下降的趨勢，說明并不是顆粒度越細(xì)得膏率越高。粉碎度在50～100目范圍內(nèi)有利于提高五味子飲片的浸出物得率。

指紋圖譜研究表明，粉碎度在65～80目范圍內(nèi)樣品指紋圖譜指紋峰總面積最大(9016.4)，其次是80～100目(總面積8964.9)和50～65目(總面積8873.2)。

結(jié)合五味子浸出物得率、以及有效成分五味子醇甲與五味子甲素的提取率測定結(jié)果和HPLC指紋圖譜研究結(jié)果，我們初步認(rèn)為50～80目范圍的五味子粉末飲片的溶出效果最佳。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.一部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:61－62.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.一部［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:X A，附錄62.

［3］中藥飲片炮制工藝與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及GMP實施實用手冊［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2006，1 033－1 038.

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