百色市某醫(yī)院白假絲酵母菌基因分型與耐藥相關(guān)性分析

陳文成+農(nóng)樂(lè)根+覃羽華

【摘要】目的分析當(dāng)?shù)爻Ｒ?jiàn)的白假絲酵母菌基因型及其耐藥性。方法收集2011年1月～2013年1月右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院190株白假絲酵母菌菌株，應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)其25SrDNA中的transposable intron基因進(jìn)行基因型分析。應(yīng)用MicroScan全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀，對(duì)標(biāo)本分離出的白假絲酵母菌進(jìn)行鑒定和藥物敏感試驗(yàn)。結(jié)果感染的190株白假絲酵母菌大多數(shù)為A型，共112株（58.95%）；A型對(duì)5氟胞嘧啶、伊曲康唑和伏立康唑的耐藥率高于B型和C型；A、B、C三型對(duì)氟康唑全部耐藥，而對(duì)兩性霉素均敏感。結(jié)論不同基因型的白假絲酵母菌對(duì)藥物的敏感性不同，應(yīng)針對(duì)不同基因型別的白假絲酵母菌應(yīng)用不同的藥物進(jìn)行治療。

【關(guān)鍵詞】白假絲酵母菌；基因分型；耐藥性

中圖分類號(hào)：R34 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.03.003

Analysis of correlation of genotyping and drug resistance

of candida albicans in a hospital in Baise

CHEN Wencheng，NONG Legen，QIN Yuhua▲

（Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

【Abstract】ObjectiveTo analyze genotyping and drug resistance of candida albicans which is normally seen in the local region.MethodsA total of 190 strains of candida albicans were collected from Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities from January，2011 to January，2013.Transposable intron gene in 25SrDNA were analyzed by polymerase chain reaction （PCR），identification of candida albicans which was isolated from the specimen and its drug sensitivity test were performed by MicroScan automatic bacterial identification instrument.Results Majority of the 190 infected candida albicans were type A，with a total number of 112 strains（58.95%）.Drug resistance rate of genotype A to 5fluorocytosine，itraconazole and voriconazole was significantly higher than those of genotype B and genotype C.Genotype A，genotype B and genotype C were all resistant to fluconazole，but sensitive to amphotericin.ConclusionDifferent genotypes of candida albicans has different sensitivity to drugs.Thus，different genotypes of candida albicans should be treated by different drugs.

【Key words】candida albicans；genotype；drug resistance

白假絲酵母菌（Candida albicans）是人體內(nèi)常見(jiàn)的條件致病真菌，近年來(lái)，由于濫用廣譜抗生素、大量使用免疫抑制劑以及廣泛運(yùn)用侵入性技術(shù)等原因，導(dǎo)致白假絲酵母菌的感染率顯著增加。白假絲酵母菌感染的特征之一就是存在地區(qū)差異，不同地區(qū)引起感染的白假絲酵母菌的類型不一樣[1]，因此，研究不同地區(qū)白假絲酵母菌的基因型和耐藥性有十分重要的意義。本研究應(yīng)用PCR技術(shù)和常規(guī)的藥敏試驗(yàn)對(duì)分離的190株白假絲酵母菌菌株中的25SrDNA進(jìn)行基因型和耐藥性分析，為臨床診斷和治療提供有利的依據(jù)。

1材料與方法1.1菌株 收集2011年1月～2013年1月右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院190株白假絲酵母菌菌株，分別來(lái)源于男性151例，女性39例，年齡≥45歲。菌株主要來(lái)自痰標(biāo)本（80.64%），其余為咽拭子、尿液、血液、傷口分泌物、大便、穿刺液等標(biāo)本。所有白假絲酵母菌均經(jīng)革蘭氏染色鏡檢確認(rèn)，用MicroScan全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。標(biāo)準(zhǔn)菌株：白假絲酵母菌ATCC90028。

1.2培養(yǎng)基血平板、中國(guó)蘭培養(yǎng)基、CHROMagar培養(yǎng)基。

1.3PCR試劑Taq PCR MasterMix 購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。PCR儀為美國(guó)BioRad基因擴(kuò)增儀。引物：25SrDNA引物：L（5ATA AGG GAA GTC GGCAAA ATA GAT CCG TAA3）和R（5CCTTGG CTG TGG TTT CGC TAG ATA GTAGAT3），由華大中生科技有限公司合成。endprint

1.4方法

1.4.1細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定應(yīng)用MicroScan全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀，選擇細(xì)菌鑒定與微量MIC復(fù)合板進(jìn)行微生物鑒定和藥物敏感試驗(yàn)。結(jié)果按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)（2010版）判定。采集患者的咽拭子、痰、氣管沖洗物、血液、濃液、糞便等標(biāo)本，接種于血平板、中國(guó)蘭培養(yǎng)基、CHROMagar培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，用糖發(fā)酵（葡萄糖、乳糖、麥芽蓎、甘糖、蔗糖、纖維雙糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、棉子糖、鼠李糖、海藻糖）實(shí)驗(yàn)、革蘭染色及血清學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行菌種鑒定。接種沙保培養(yǎng)基4℃保存，轉(zhuǎn)種馬鈴薯培養(yǎng)基37℃48～72小時(shí)備用。

1.4.2藥敏試驗(yàn) 白假絲酵母菌藥敏試驗(yàn)選用臨床常用的抗真菌藥物（5氟胞嘧啶、氟康唑、伏立康唑、兩性霉素、伊曲康唑）進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。

1.4.3提取白假絲酵母菌DNA用酚氯仿抽提法提取白假絲酵母菌DNA，取2～3種馬鈴薯培養(yǎng)基白假絲酵母菌溶解于200 μL E 液，加入250 μL GPT試劑，離心12 000轉(zhuǎn)5分鐘，加入等體積的100%異戊醇和1/10醋酸鈉溶液-20℃放置1小時(shí)，離心12 000轉(zhuǎn)20分鐘，用70%冰酒精脫水，無(wú)菌TE 液溶解備用。

1.4.4基因分析應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)其25SrDNA中的transposable intron基因進(jìn)行基因型分析，通過(guò)其擴(kuò)增的片段大小，將白假絲酵母菌分成三組：A組（片段大小約450 bp）、B組（840 bp）、C組（450 bp和840 bp）；引物：L（5ATA AGG GAA GTC GGCAAA ATA GAT CCG TAA3）和R （5CCTTGG CTG TGG TTT CGC TAG ATA GTAGAT3）。在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳后，在紫外光透射儀上觀察，攝片并記錄結(jié)果。

1.5結(jié)果判定根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和條帶數(shù)目確定基因型，一條450 bp帶為A型，一條840 bp帶為B型，一條450 bp帶和一條840 bp帶為C型。

1.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)記錄白假絲酵母菌的基因分型結(jié)果和藥敏試驗(yàn)結(jié)果并分析其相關(guān)性。

2結(jié)果2.1基因分型結(jié)果190株白假絲酵母菌菌株的基因分型根據(jù)電泳圖譜分為A、B、C三型（見(jiàn)圖1），其中A型112株（58.95%），B型58株（30.53%），C型20株（10.53%）。

2.2藥敏試驗(yàn)結(jié)果不同基因型白假絲酵母菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 白假絲酵母菌基因分型結(jié)果。

表1不同基因型白假絲酵母菌藥敏結(jié)果（%）

藥物A型（112株）SIRB型（58株）SIRC型（20株）SIR5氟胞嘧啶84.2105.71000010000氟康唑001000010000100伏立康唑84.2015.292.61.16.193.36.70兩性霉素94.75.201000010000伊曲康唑26.32152.684.25.310.575.66.717.8注：S表示敏感；I表示中介；R表示耐藥。

2.3基因型與藥敏相關(guān)性分析本實(shí)驗(yàn)顯示本地感染的白假絲酵母菌大多數(shù)為A型，在5氟胞嘧啶、氟康唑、伏立康唑、兩性霉素、伊曲康唑5種常見(jiàn)的抗真菌藥中，A型對(duì)5氟胞嘧啶、伊曲康唑和伏立康唑的耐藥率高于B型和C型；A、B、C三型對(duì)氟康唑全部耐藥，而對(duì)兩性霉素均敏感。

3討論白假絲酵母菌是人體內(nèi)常見(jiàn)的條件致病真菌，也是最常見(jiàn)的引起深部感染的真菌，越來(lái)越受到醫(yī)學(xué)界的重視[2～4]。全球不同地區(qū)、不同人種中，白假絲酵母菌感染的流行病學(xué)特征不同；不同地區(qū)引起感染的白假絲酵母菌的類型不一樣，由于類型不同，其引起感染的癥狀、對(duì)藥物的敏感性及流行病學(xué)特征均不同。研究表明，許多院內(nèi)白假絲酵母菌感染是由內(nèi)源性感染引起，但真菌外源性感染也是不可忽視的問(wèn)題[5，6]。因此，研究當(dāng)?shù)氐陌准俳z酵母菌感染的基因類型和藥物敏感性將有助于了解該地區(qū)醫(yī)院院內(nèi)白假絲酵母菌感染的臨床特點(diǎn)、菌種分布特征及誘發(fā)該菌感染的危險(xiǎn)因素，有助于真菌標(biāo)本的快速檢驗(yàn)和鑒定，有助于真菌感染性疾病的早期診斷、早期治療[7～9]。并且可以和其他地區(qū)的相關(guān)資料進(jìn)行比對(duì)，對(duì)預(yù)防和治療白假絲酵母菌感染，提高對(duì)醫(yī)院內(nèi)感染的認(rèn)識(shí)均有重要意義。本研究應(yīng)用PCR技術(shù)和常規(guī)的藥敏試驗(yàn)對(duì)從本院患者分離的白假絲酵母菌菌株中的25SrDNA進(jìn)行基因型和耐藥性分析。研究結(jié)果顯示：190株白假絲酵母菌菌株中，A型占了大多數(shù)（58.95%），C型比較少見(jiàn)，未檢出D型和E型。不同基因型白假絲酵母菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，在5氟胞嘧啶、氟康唑、伏立康唑、兩性霉素、伊曲康唑5種常見(jiàn)的抗真菌藥中，A型對(duì)5氟胞嘧啶、伊曲康唑和伏立康唑的耐藥率高于B型和C型；A、B、C三型對(duì)氟康唑全部耐藥，而對(duì)兩性霉素均敏感。

本實(shí)驗(yàn)所用190株白假絲酵母菌菌株全部分離自我院住院患者，年齡≥45歲，主要以肺部感染疾病為主，并伴有一種或多種基礎(chǔ)疾病，菌株主要來(lái)源于痰標(biāo)本，均有長(zhǎng)期大量使用抗生素的病史。研究表明，長(zhǎng)期大劑量接受抗生素治療使自身正常菌群受到破壞，機(jī)體免疫功能減弱，給真菌的感染創(chuàng)造了良好的條件[10]。了解我院不同基因型別的白假絲酵母菌的分布及耐藥情況，將有助于發(fā)現(xiàn)易感菌株，對(duì)醫(yī)院感染源的追蹤和研究真菌感染情況，指導(dǎo)臨床用藥有重要的意義，對(duì)白假絲酵母菌的流行病學(xué)的研究有重要價(jià)值。參考文獻(xiàn)[1] Myoung Y，Shin JH，Lee JS，et al.Multilocus sequence typing for Candida albicans isolates from candidemic patients：comparison with southern blot hybridization and pulsedfield gel electrophoresis analysis[J].Korean J Lab Med，2011，31（2）：107114.endprint

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（收稿日期：2015-03-31修回日期：2015-06-13）

（編輯：潘明志）endprint