指紋圖譜在中藥柴胡質(zhì)量評價中的應(yīng)用研究

王斌 張騰霄 宋相周 唐志國 楊國亮 曹玉銘

（1.綏化學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院；2.綏化市食品藥品檢驗檢測中心 黑龍江綏化 152061）

《中國藥典》2010版收載的柴胡為傘形科多年生草本植物柴胡（北柴胡）BupleurumchineseDC.和狹葉柴胡（南柴胡）BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根,近代藥理研究表明柴胡具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)咳、抗炎、保肝利膽等藥理活性[1]。由于中藥成分復(fù)雜，單一成分作為質(zhì)量控制指標已不能適應(yīng)中藥質(zhì)量控制的要求。而中藥指紋圖譜可反映中藥的整體化學(xué)特征及其多組分、多作用靶點的特點。對中藥“安全、有效和質(zhì)量可控，保證物種的延續(xù)，遺傳基因的穩(wěn)定性，品種的地道性和藥用價值”起著至關(guān)重要的作用。本文通過文獻檢索的方式，對近年來指紋圖譜在中藥柴胡質(zhì)量評價中的應(yīng)用進行綜述，為柴胡的進一步研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

一、中藥指紋圖譜

中藥指紋圖譜技術(shù)指某種（或某產(chǎn)地）中藥材或經(jīng)適當?shù)奶幚砗?，采用一定的分析手段得到的能夠標志該中藥材或中成藥特征的譜圖。中藥指紋圖譜能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進而對藥品質(zhì)量進行整體描述和評價。中藥指紋圖譜主要分為化學(xué)指紋圖譜（包括色譜指紋圖譜、光譜指紋圖譜）和DNA指紋圖譜。

二、指紋圖譜在柴胡質(zhì)量評價中的應(yīng)用

（一）色譜技術(shù)指紋圖譜。色譜技術(shù)是中藥化學(xué)成分分離分析及質(zhì)量評價和控制的核心技術(shù)，其中薄層色譜（TLC）應(yīng)用最早，目前高效液相色譜（HPLC）技術(shù)逐漸成為中藥質(zhì)量評價的主要技術(shù)，其他還有氣相色譜法（GC）和高效毛細管電泳（HPCE）等。

1.TLC法。李騰等[2]利用TLC指紋圖譜技術(shù)，揭示柴胡及其制劑前后皂苷類成分的變化，展開劑為三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶4∶2∶1)，顯色劑為1%對二甲氨基苯甲醛乙醇溶液-磷酸(3∶1)，檢視條件為365nm。經(jīng)TLC法對比柴胡經(jīng)煎煮制成制劑前后，發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷d可轉(zhuǎn)化成柴胡皂苷b2，柴胡皂苷a與柴胡皂苷c基本沒有變化，有助于揭示中藥柴胡發(fā)揮功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.HPLC法。高效液相指紋圖譜，即色譜技術(shù)對中藥所含化合物進行分離和檢測，得到表征各類成分的系列色譜峰，通過色譜峰的數(shù)目、峰位和峰高度的特異性構(gòu)建特定化學(xué)指紋圖譜，該指紋圖譜反映出研究對象的精細化學(xué)構(gòu)成特征，可用于中藥的鑒定和質(zhì)量評價。

（1）皂苷類成分。李騰等[2]利用HPLC指紋圖譜技術(shù)，揭示柴胡及其制劑前后皂苷類成分的變化。采用Waters XBridgeRP18色譜柱，乙腈-水為流動相，檢測波長208、252nm。經(jīng)HPLC指紋圖譜對比研究，進一步證明了柴胡皂苷d向柴胡皂苷b2轉(zhuǎn)化。余菁等[3]建立HPLC方法測定柴胡皂苷a、d含量。色譜柱為YMC-PackODS-AC18，乙腈-水(43∶57)為流動相，檢測波長為203nm。白雪梅等[4]建立同時測定柴胡中柴胡皂苷a及柴胡皂苷d的高效液相色譜法。色譜柱為HypersilBDSC18，檢測波長:210nm，流動相為乙腈∶水=50∶50。劉曉節(jié)等[5]采用HPLC柱前酸化法測定北柴胡引種前后和不同品種藥材中柴胡皂苷a、d的含量。黃春燕等[6]采用HPLC測定不同產(chǎn)地北柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的含量，以kromasilC18為色譜柱；流動相為乙腈-水，檢驗波長204nm。李棣華等[7]建立HPLC指紋圖譜分析方法，測定了10個不同來源山西產(chǎn)柴胡樣品。林東昊等[8]建立RP-HPLC法，分離和測定中國23種61個產(chǎn)地的柴胡屬植物樣品中柴胡皂苷a、c、d的含量。采用C18色譜柱，以乙腈-水為流動相，檢測波長210nm。

張宏娜等[9]建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HPLC-ELSD）法同時測定柴胡中柴胡皂苷a、c、d、f含量。采用PhenomenexC18色譜柱，以乙腈-水為流動相。茅仁剛等[10]所建立的RP-HPLC法適合不同品種柴胡中柴胡皂苷a、c、d的定量分析。李媛媛等[11]利用柱前衍生化HPLC-UV測定柴胡皂苷a、d的含量。評價不同產(chǎn)地、不同品種柴胡樣品的質(zhì)量優(yōu)劣。聶颯等[12]利用HPLC法建立了凈柴胡和醋柴胡的指紋圖譜，并初步研究了二者之間差別。趙麗等[13]研究柴胡總苷的高效液相色譜指紋圖譜，測定柴胡總苷中柴胡苷a、d的含量。利用HPLC-DAD法測定了10批柴胡總皂苷樣品。宋宏剛等[14-16]采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射(HPLC-ELSD)法建立柴胡中柴胡皂苷a及柴胡皂苷d的含量測定方法。李艷榮等[17]建立同時測定柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量及其HPLC指紋圖譜。采用Zorbax SB-C18色譜柱，乙腈溶液系統(tǒng)梯度洗脫，檢測波長210nm。15批藥材的HPLC指紋圖譜共確立6個共有峰。李競等[18]采用HPLC法，以C18色譜柱、乙腈-水為流動相，檢測波長為210nm，測定樣品中柴胡皂苷a、d的含量。

（2）黃酮類成分。袁王俊等[19]定量測定不同部位和不同產(chǎn)地柴胡中4種黃酮（蘆丁、槲皮素、山柰素、異鼠李素）。以O(shè)DS2色譜柱、乙腈-0.12%磷酸水為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為360nm。為柴胡莖、葉進行進一步的研究和開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。韋英杰等[20]建立HPLC法同時測定柴胡和春柴胡中柴胡皂苷a、d；4個黃酮類活性成分蘆丁、槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量。采用AgilentZorbaxC18色譜柱，以0.1%磷酸水-乙腈為流動相。

3.GC法。氣相色譜是封閉性色譜，受外界影響較少，具有高性能、高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點。適合于藥材及制劑中揮發(fā)性成分且熱穩(wěn)定性藥材的鑒定。郭雪清等[21]應(yīng)用GC法建立柴荊注射液中柴胡揮發(fā)油的指紋圖譜，為柴荊注射液的質(zhì)量控制提供依據(jù)。孫玲等[22]運用毛細管氣相色譜法建立柴胡揮發(fā)油的指紋圖譜。從6批道地藥材產(chǎn)區(qū)的柴胡揮發(fā)油GC指紋圖譜中確定16個共有峰，并進行不同產(chǎn)區(qū)柴胡相似度的比較，相似度大于0.9。李秀琴等[23]建立評價柴胡揮發(fā)油質(zhì)量優(yōu)劣的指紋圖譜分析方法。采用毛細管氣相色譜分析，以正壬烷為內(nèi)參照物，測定了25批不同產(chǎn)地柴胡藥材的GC指紋圖譜。

4.GC-MS法。GC-MS鑒定技術(shù)是目前分析和鑒別具有揮發(fā)性、半揮發(fā)性成分中藥的首選技術(shù)。廖遠熹等[24]運用靜態(tài)頂空毛細管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速鑒別市售柴胡是否經(jīng)硫黃熏制。孫宗喜等[25]通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)對柴胡根和莖中的揮發(fā)油成分進行分析和鑒定，用色譜峰面積歸一化法計算各組分的相對百分含量。馬璇等[26]采用GC-MS技術(shù)，從提取的北柴胡地上部分揮發(fā)油中鑒定出25個化合物，地下部分鑒定出14個化合物。

（二）光譜技術(shù)指紋圖譜。

1.紫外光譜法（UV）。根據(jù)不同藥材紫外吸收光譜互異這一特性進行鑒別。如紫外吸收峰位置和數(shù)目的差異。李競等[18]采用紫外分光光度法，以柴胡皂苷d為對照品，在波長545nm處對樣品中的總皂苷進行含量測定。許臘英等[27]用紫外譜線組法鑒別柴胡和醋柴胡，比較炮制前后的變化。

2.原子吸收光譜。劉偉等[28]考察栽培柴胡藥材的重金屬含量情況。以原子吸收光譜法測定樣品中的鉛、鎘、砷、汞和銅的含量。該法快速、可靠，為柴胡重金屬元素的測定提供了一種簡便方法。

（三）分子技術(shù)指紋圖譜。

1.DNA條形碼指紋圖譜技術(shù)。DNA條形碼是指利用基因組中一段公認標準的、相對較短的DNA片段作為物種標記而建立的一種新的生物鑒定方法。該方法通過篩選確定通用條形碼，建立條形碼數(shù)據(jù)庫和鑒定平臺，通過生物信息學(xué)分析方法分析比對DNA數(shù)據(jù)，進而對物種進行鑒定。遲瑩等[29]采用改良的CTAB法提取柴胡及常見偽品的干根基因組DNA，設(shè)計鑒別正品柴胡及其偽品的特異性引物，利用PCR擴增技術(shù)對正品柴胡及其偽品進行DNA指紋鑒定。

2.隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）指紋圖譜。根據(jù)PCR技術(shù)，采用人工合成的隨機引物，以植物組織分離的基因組DNA為模板，進行多態(tài)性DNA片段的隨機合成反應(yīng)，從而根據(jù)DNA片段，將植物不同基因組予以區(qū)別。

南曉潔等[30]比較研究了用不同方法提取柴胡樣品基因組DNA，探索了一種適用于柴胡藥材干根DNA提取的方法，為實現(xiàn)以分子標記方法辨別柴胡藥材奠定基礎(chǔ)。

3.生物芯片技術(shù)（Bio-chip）。將大量探針分子（DNA，RNA）固定在支持物上后，與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度，對樣品分子進行定性、定量和結(jié)構(gòu)分析。

4.簡單重復(fù)序列間標記技術(shù)(ISSR)。ISSR標記是適于種間或種內(nèi)變異調(diào)查的一種分子標記方法，其結(jié)果可用來建立中藥的指紋圖譜。隋春等[31]建立了柴胡ISSR-PCR反應(yīng)體系，篩選出30條引物并確定了最佳退火溫度，為應(yīng)用ISSR技術(shù)鑒定柴胡種質(zhì)資源、分子標記輔助選擇育種及其遺傳多樣性研究奠定了基礎(chǔ)。

三、總結(jié)

通過文獻檢索的方式，對近10年來薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、紫外光譜法、原子吸收光譜、DNA指紋圖譜在中藥柴胡質(zhì)量評價中的應(yīng)用進行總結(jié)，為柴胡的進一步的研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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