拉曼光譜在口腔醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

薛麗麗 閆冰 李一

1.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科；2.耳鼻喉頭頸外科，廈門 361003；3.口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院頭頸腫瘤外科（四川大學(xué)），成都 610041

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，特別是交叉學(xué)科的興起和發(fā)展，光譜學(xué)被越來越多地應(yīng)用在醫(yī)學(xué)研究中。光譜學(xué)主要是通過分析樣本的反射光和吸收光之間的改變而研究被測(cè)樣本的一門學(xué)科。在醫(yī)學(xué)研究中，光譜學(xué)主要涉及紅外光譜、熒光光譜和拉曼光譜[1]。相對(duì)于前兩者而言，拉曼光譜具有光譜信息豐富，對(duì)樣本無需特殊處理和受組織內(nèi)水分影響小等優(yōu)點(diǎn)，近年來成為臨床原位診斷技術(shù)的研究熱點(diǎn)[2]。本文通過復(fù)習(xí)文獻(xiàn)，對(duì)拉曼光譜在口腔醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用作一綜述。

1 拉曼光譜的原理

拉曼散射是由印度科學(xué)家拉曼于1928年發(fā)現(xiàn)[3]。從量子力學(xué)的角度解釋，拉曼散射是指一部分光射向物體后發(fā)生的非彈性散射，其光子的能量被物體分子中處于基態(tài)的電子獲取使得電子躍遷至一個(gè)虛態(tài)，處于虛態(tài)的電子不穩(wěn)定，有向外釋放能量回到穩(wěn)態(tài)的趨勢(shì)，向外釋放的能量以光子的形態(tài)釋放出來，釋放出這部分光的波長(zhǎng)與入射光不同，稱作拉曼散射[1,3]。

拉曼圖譜是將拉曼散射中散射光和入射光之間的頻率改變轉(zhuǎn)化為圖譜形式，通常將拉曼散射的強(qiáng)度相對(duì)波長(zhǎng)的函數(shù)圖稱為拉曼光譜。在拉曼圖譜中，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類和核酸等生物大分子都有其對(duì)應(yīng)的頻移譜帶，通過分析這些譜帶的變化就可以獲取這些生物大分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，因此拉曼光譜又被稱為“分子指紋”[4]。

隨著儀器設(shè)備的不斷發(fā)展，拉曼光譜技術(shù)也發(fā)展為顯微拉曼光譜技術(shù)、共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)、表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)等。顯微拉曼光譜技術(shù)是將顯微技術(shù)與拉曼光譜結(jié)合，可以檢測(cè)如單個(gè)細(xì)胞等微小樣本；共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)則是結(jié)合激光共聚焦原理能夠更加精確地檢測(cè)樣本的拉曼信號(hào)；表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)則是借助貴金屬表面特有的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)可以指數(shù)級(jí)地增強(qiáng)拉曼信號(hào)強(qiáng)度。隨著拉曼光譜技術(shù)的發(fā)展，從對(duì)組織標(biāo)本的研究到單個(gè)細(xì)胞的檢測(cè)[5-6]，從對(duì)病變組織的檢測(cè)到臨床疾病診斷模型的建立[7-8]，從癌癥組織檢測(cè)到體液標(biāo)本的鑒定[9-10]，拉曼光譜技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，具有巨大的應(yīng)用潛力。

2 拉曼光譜在口腔醫(yī)學(xué)不同學(xué)科中的應(yīng)用

2.1 拉曼光譜在口腔內(nèi)科學(xué)中的應(yīng)用

Guze等[11]利用光導(dǎo)纖維探頭獲得51個(gè)健康志愿者（25個(gè)高加索人和26個(gè)亞洲人）口腔內(nèi)不同部位正常黏膜的拉曼光譜。他們使用785 nm、30 mW的近紅外激光在不同部位的口腔黏膜處照射1 s，獲得正常黏膜的拉曼光譜，結(jié)果顯示：口腔正常黏膜在1 665 cm-1附近有較強(qiáng)的峰值，其對(duì)應(yīng)的是蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ；而在2 900 cm-1處的峰值則表示是脂質(zhì)和蛋白質(zhì)相關(guān)分子鍵的振動(dòng)。該研究表明不同部位黏膜的拉曼光譜不同，主要跟黏膜的角化程度有關(guān)，而與年齡和性別無關(guān)。這項(xiàng)研究為拉曼光譜應(yīng)用于口腔黏膜疾病的臨床原位無創(chuàng)診斷打下基礎(chǔ)。

Zenone等[12]通過對(duì)新鮮的口腔天皰瘡黏膜標(biāo)本和正常黏膜標(biāo)本的顯微拉曼光譜研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常黏膜，天皰瘡病變黏膜在644、1 234、1 423、1 657 cm-1處發(fā)生明顯改變，可以很好地鑒別天皰瘡黏膜組織和正常黏膜組織，具有高度靈敏性。進(jìn)一步研究[13]發(fā)現(xiàn)，天皰瘡患者和正常人血漿的拉曼光譜也存在差異；由于血漿獲取方便，可以借助拉曼光譜對(duì)天皰瘡等口腔黏膜疾病進(jìn)行鑒別診斷[13]。

舍格倫綜合征是一種自身免疫性疾病，其特征表現(xiàn)為外分泌腺如淚腺、唾液腺的進(jìn)行性破壞，導(dǎo)致眼干、口干為主要臨床表現(xiàn)的病征。舍格倫綜合征的臨床診斷主要依據(jù)唇腺活檢。薛麗麗等[14]通過對(duì)正常唇腺及病變唇腺的拉曼光譜進(jìn)行分析，確定了舍格倫綜合征病變唇腺光譜的診斷價(jià)值，并通過化學(xué)計(jì)量學(xué)建立診斷模型，可以很好地鑒別病變唇腺及正常唇腺，為拉曼光譜技術(shù)在舍格倫綜合征病變唇腺的檢測(cè)提供了可能。

在對(duì)牙齒礦化組織進(jìn)行的拉曼光譜研究中發(fā)現(xiàn)，在959 cm-1處有一個(gè)強(qiáng)峰值，其位置表示的是磷酸根的振動(dòng)，此峰值強(qiáng)度從釉質(zhì)、釉牙本質(zhì)界到牙本質(zhì)逐漸減弱，按組織學(xué)上無機(jī)礦物質(zhì)從釉質(zhì)到牙本質(zhì)逐漸減少來分析，說明其峰值強(qiáng)度與磷酸鹽含量有關(guān)[15]。Ko等[16]在研究釉質(zhì)拉曼光譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，釉質(zhì)光譜具有較強(qiáng)的偏振各向異性，而發(fā)生齲壞的釉質(zhì)的偏振各向異性較弱。正常釉質(zhì)在959 cm-1有較強(qiáng)的峰值，表示的是磷酸鹽的含量較高，而齲壞釉質(zhì)在959 cm-1峰值較正常釉質(zhì)弱，提示釉質(zhì)脫礦導(dǎo)致其磷酸鹽含量減少。Ko等[17]通過改進(jìn)拉曼光譜系統(tǒng)，利用光導(dǎo)纖維收集釉質(zhì)的拉曼光譜，取得了良好的效果，顯示了拉曼光譜診斷早期齲壞的潛力。

在牙周炎診斷方面，拉曼光譜技術(shù)也表現(xiàn)出巨大的潛力。Gonchukov等[18]對(duì)風(fēng)干的唾液進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜可以很好地檢測(cè)出一些唾液中大分子生物標(biāo)志物，牙周炎患者唾液光譜中波數(shù)1 155、1 525、1 033和1 611 cm-1對(duì)應(yīng)的生物標(biāo)志物與正常對(duì)照組唾液有所不同，提示牙周炎患者唾液中類胡蘿卜素、糖蛋白、黏蛋白基質(zhì)等物質(zhì)發(fā)生改變，可作為鑒別診斷依據(jù)將牙周炎患者與正常人群區(qū)分。

2.2 拉曼光譜在口腔材料學(xué)及修復(fù)科學(xué)中的應(yīng)用

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的新型醫(yī)用材料被應(yīng)用到口腔科學(xué)的臨床治療當(dāng)中，拉曼光譜為這些材料的研究提供了一種新方法。Gauthier等[19]通過分析拉曼光譜中二甲基丙烯酸單體中C=C雙鍵的強(qiáng)度來檢測(cè)樹脂的固化程度，結(jié)果表明：應(yīng)用拉曼光譜檢測(cè)樹脂固化程度的準(zhǔn)確性與傳統(tǒng)方法一致，為檢測(cè)樹脂固化程度提供了新的便捷方法。Khalil等[20]和Cassoni等[21]分別應(yīng)用拉曼光譜對(duì)牙科復(fù)合樹脂的聚合程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，均獲得了滿意的效果。復(fù)合樹脂粘接劑是通過滲透到經(jīng)酸蝕脫礦的牙本質(zhì)表面起到粘接作用的，應(yīng)用拉曼光譜和掃描電子顯微鏡技術(shù)，對(duì)比研究一步酸蝕法處理后樹脂滲透進(jìn)牙本質(zhì)的程度，發(fā)現(xiàn)拉曼光譜可以準(zhǔn)確地反應(yīng)樹脂滲透的部位，對(duì)滲透深度的檢測(cè)較掃描電子顯微鏡更加準(zhǔn)確[22]。Lopes等[23]在研究激光對(duì)種植體周圍成骨性的生物調(diào)節(jié)作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜可以簡(jiǎn)單準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)種植體周圍的成骨量和骨質(zhì)量，這為種植體周圍骨愈合研究提供了一種新技術(shù)。

2.3 拉曼光譜在口腔頜面外科學(xué)中的應(yīng)用

口腔癌的發(fā)病率和死亡率在頭頸部惡性腫瘤中均比較高，能否早期診斷是決定預(yù)后的關(guān)鍵[24]。Oliveira等[24]和Malini等[25]通過對(duì)口腔黏膜組織切片的拉曼光譜進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜能夠鑒別正常組織、炎癥組織、癌前病變和癌變組織。正常黏膜組織在1 750 cm-1處C=C和1 650 cm-1處C=O鍵的峰值弱且譜峰尖銳，1 080 cm-1處譜峰寬大，表明磷酸磷脂含量較高；而癌變組織在1 650、1450 cm-1處及1 200～1 350 cm-1處譜峰值強(qiáng)且譜帶寬大，這些分別表示酰胺Ⅰ、CH2和酰胺Ⅲ，說明癌變組織中蛋白質(zhì)含量明顯升高。還有學(xué)者[26]利用拉曼光譜對(duì)活體小鼠口腔上腭黏膜進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜對(duì)上腭黏膜各種程度的非典型增生及原位癌具有良好的鑒別能力，靈敏度和特異性均在90%以上，特別是對(duì)原位癌和重度非典型增生的鑒別靈敏度和特異性均為100%。Li等[27]對(duì)口腔黏膜鱗狀細(xì)胞癌和白斑病變組織的拉曼光譜進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常黏膜相比，癌變及白斑黏膜拉曼光譜中核酸及蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的譜峰明顯增強(qiáng)，通過支持向量機(jī)建立鑒別診斷模型，診斷準(zhǔn)確率達(dá)到95%以上。通過拉曼光譜對(duì)舌黏膜的原位癌和浸潤(rùn)性鱗狀細(xì)胞癌的研究也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。在原位癌和浸潤(rùn)性鱗狀細(xì)胞癌的拉曼光譜中，一些蛋白質(zhì)的相關(guān)譜峰較正常黏膜增強(qiáng)，可以用來作為鑒別正常組織與癌變組織的依據(jù)；通過統(tǒng)計(jì)分析，可以很好地將正常舌黏膜與癌變組織區(qū)分開來，準(zhǔn)確率達(dá)90%左右[28]。

腮腺腫瘤的術(shù)前診斷一直依賴于細(xì)針穿刺活檢技術(shù)，而Yan等[29]的研究為拉曼光譜技術(shù)用于腮腺腫瘤的鑒別診斷提供了理論基礎(chǔ)。Yan等[29]將腮腺多形性腺瘤、Warthin瘤及腮腺正常組織進(jìn)行拉曼光譜研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：腫瘤組織中核酸和蛋白質(zhì)相關(guān)譜峰較正常組織增高，而正常腮腺中的脂類譜峰明顯高于腫瘤組織；以此作為診斷依據(jù)，通過支持向量機(jī)對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，成功鑒別出不同腫瘤及正常腮腺組織，其總體準(zhǔn)確率達(dá)95%以上。

放射性骨壞死或骨髓炎是頭頸部惡性腫瘤經(jīng)過放射治療后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。臨床上如果能早期鑒別出壞死骨組織和正常骨組織，不僅可以早期診斷，同時(shí)可以減少骨組織的切除范圍，為后期修復(fù)手術(shù)創(chuàng)造便利條件[1]。McCreadie等[30]對(duì)發(fā)生過骨折及正常的股骨頭組織標(biāo)本進(jìn)行拉曼光譜研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生過骨折的標(biāo)本的骨組織成分與正常組有明顯差異，表明拉曼光譜可以鑒別骨組織內(nèi)的病理生理改變。Draper等[31]利用可穿透皮膚的拉曼光譜技術(shù)對(duì)小鼠骨骼進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所得到的光譜與直接暴露的骨骼光譜相似。該技術(shù)是在普通拉曼光譜儀中加入濾波器，將皮膚和肌肉散射的拉曼光譜過濾掉，而只接收深層組織的拉曼光譜[31-32]。這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用，使得拉曼光譜應(yīng)用于臨床檢測(cè)體內(nèi)深部組織或器官如骨骼組織等成為可能。Lakshmi等[4]在對(duì)下頜骨放射性骨壞死的研究中發(fā)現(xiàn)，拉曼光譜對(duì)骨組織中礦物質(zhì)和有機(jī)物等成分的改變敏感，可以用來評(píng)價(jià)其有機(jī)和無機(jī)基質(zhì)的破壞或改變。該研究將正常骨組織、放射治療后骨組織和發(fā)生放射性骨壞死的骨組織進(jìn)行研究，拉曼光譜顯示：發(fā)生放射性骨壞死樣本的無機(jī)基質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，膠原蛋白變性，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞減少；將所得的拉曼光譜通過主成分分析法進(jìn)行計(jì)算，3組之間的拉曼光譜存在明顯差異，提示拉曼光譜可以很好地鑒別經(jīng)過放射治療的骨組織是否發(fā)生放射性骨髓炎或骨壞死。

3 結(jié)束語(yǔ)

拉曼光譜的優(yōu)點(diǎn)如下：1）在病變組織尚未發(fā)生形態(tài)學(xué)改變時(shí)，拉曼光譜就可檢測(cè)出樣本中因細(xì)胞增殖、分化或惡變等引起的生物大分子結(jié)構(gòu)、成分和含量的改變，在腫瘤等疾病的早期診斷中有較高的優(yōu)勢(shì)；2）拉曼光譜可以實(shí)時(shí)、無創(chuàng)、快速對(duì)疾病進(jìn)行診斷和檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)樣本無需特殊處理，方便快速，樣本可以反復(fù)使用，不僅可以檢測(cè)常規(guī)病變組織，還可以檢測(cè)骨骼和牙齒等高度礦化組織；3）拉曼光譜可以用于分析牙科材料的分子結(jié)構(gòu)和組成，為新材料分析研究提供有力幫助。綜上所述，拉曼光譜技術(shù)在口腔醫(yī)學(xué)中具有良好的應(yīng)用前景。

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