豬多殺性巴氏桿菌的鑒定方法和耐藥性的研究進展

彭苗苗，傅勝才

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128；2.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長沙410131)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)遍布世界各地，是多種動物的重要病原菌，本菌以莢膜抗原和菌體抗原區(qū)分血清型，前者有5個型，后者至少有16個型。該菌正常存在于多種動物的口腔和咽部黏膜，對雞、鴨、鵝、野禽、豬、牛、羊、馬、兔等均可致病，當動物處于應激狀態(tài)和機體抵抗力下降時，細菌大量繁殖并致病，發(fā)生內(nèi)源性感染。其感染發(fā)病過程分為急性型和慢性型，急性型呈出血性敗血癥迅速死亡，如牛出血性敗血癥、豬肺疫、禽霍亂、兔巴氏桿菌病等；慢性型呈萎縮性鼻炎（豬、羊）、關節(jié)炎及局部化膿性炎癥等。自然感染病愈后的家禽對其他血清型具有交叉免疫力，但用體外人工培養(yǎng)的細菌制成的滅活苗，則不能產(chǎn)生對異種血清型的免疫。

豬多殺性巴氏桿菌病致使豬群生長緩慢，嚴重影響飼料報酬，在我國規(guī)模化豬場常有發(fā)生，并呈地方流行性和散發(fā)性流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。因分型復雜，地區(qū)差異性較大，各血清型之間交叉免疫保護作用較弱，市場上購買的疫苗往往起不到預防作用。目前，臨床上豬多殺性巴氏桿菌病的控制主要依賴于抗生素的使用，但近年來由于抗生素的大量不合理使用和濫用，使得動物源Pm表現(xiàn)為耐藥率高、耐藥范圍廣、呈多重耐藥等特點，其直接后果不僅給控制和治療該病帶來困難，而且加劇了抗生素在動物體內(nèi)的殘留，影響動物產(chǎn)品質(zhì)量，為人類健康帶來隱患。

1 豬源Pm的分子生物學鑒定研究現(xiàn)狀

對于臨床無菌采集到含有Pm的病料，一般要進行分離純化、形態(tài)學鑒定、生化鑒定、動物回歸試驗以及分子生物學鑒定共五個步驟，國內(nèi)外研究主要集中在Pm 的分子生物學的鑒定方法上。Townsend等利用基因消減的方法對Pm進行研究發(fā)現(xiàn)了Pm基因組上1個特有區(qū)域，針對該特異性DNA序列設計引物，所有的Pm都可以擴增出1個460bp的片段，即Pm-PCR。我國的唐先春等建立的PCR檢測方法來鑒定豬源Pm，對比傳統(tǒng)的生化鑒定，PCR具有特異性高、靈敏度高的特點，能檢測含菌量為103/mL（CFU=103/mL）的菌落，利用PCR鑒定Pm近年來在國內(nèi)得到了廣泛的應用。在這基礎上，黃海燕等根據(jù)GenBank已公布的多殺性巴氏桿菌plpE基因序列的保守片段設計合成引物，經(jīng)plpE基因陽性質(zhì)粒構建、反應條件的優(yōu)化、特異性試驗和敏感性試驗，對豬源多殺性巴氏桿菌特異性PCR檢測方法進行了改進優(yōu)化，此方法檢測Pm靈敏度能達到200cfu／mL。而后，吳斌等利用分離出的Pm菌株，根據(jù)NCBI上的序列（U52208）設計一對引物，用PCR方法擴增了豬源Pm的外膜蛋白（ompH），并克隆到載體pMD18-T（T-Vector）上，用pET28b-ompH，轉化BL21并誘導表達，然后用所表達的蛋白做了ELISA檢測方法的初步探討。

環(huán)介導等溫擴增技術(Loop—mediatedisothermal amplification，LAMP)是利用4個特殊設計的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地擴增DNA的新技術。孫建華等將自環(huán)介導等溫擴增技術應用于Pm的快速檢測，即以Pm的莢膜蛋白—PlpB基因為靶基因，經(jīng)反應條件優(yōu)化后建立了LAMP檢測方法，靈敏度為25cfu/mL，為傳統(tǒng)PCR靈敏度的10倍，且整個檢測時間僅為1h左右，較傳統(tǒng)PCR檢測方法具有快速、高靈敏的優(yōu)勢。DongboSun等以Pm的kmtl基因為靶基因，設計 了 四 個 特 殊 引 物 PM-F3、PM-B3、PM-FIP、PM-BIP，在63℃溫度下反應1h左右就能得出通過肉眼觀察得到檢測結果，且靈敏度達到了10cfu/mL。

雖然應用LAMP鑒定Pm具有操作簡單、視覺直觀檢測，不需要檢測儀、反應速度快、敏感性高、價格便宜等優(yōu)點，但是LAMP靈敏度高很容易污染出現(xiàn)假陽性，這在一定程度上限制了LAMP鑒定Pm的應用。目前Pm特異性PCR仍是鑒定Pm最常用的分子生物學方法。

2 豬源Pm的耐藥性研究現(xiàn)狀

耐藥性（drugresistance）又稱抗藥性，系指微生物、寄生蟲以及腫瘤細胞對于化療藥物作用的耐受性，耐藥性一旦產(chǎn)生，藥物的化療作用就明顯下降。耐藥性根據(jù)其發(fā)生原因可分為獲得耐藥性和天然耐藥性。自然界中的病原體，如細菌的某一株也可存在天然耐藥性。當長期應用抗生素時，占多數(shù)的敏感菌株不斷被殺滅，耐藥菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使細菌對該種藥物的耐藥率不斷升高。目前認為后一種方式是產(chǎn)生耐藥菌的主要原因。為了保持抗生素的有效性，應重視其合理使用；Pm耐藥得到了越來越多的關注，國內(nèi)外積極開展了豬源Pm耐藥性及耐藥性機制的相關研究。

2.1 國內(nèi)部分地區(qū)豬源Pm的耐藥性研究現(xiàn)狀

桂文龍等在蘇中地區(qū)豬場分離得到21株Pm（2011年8月到2012年12月），并選用13種抗生素進行了藥敏試驗，其中頭孢氨芐、復方新諾明、紅霉素、鏈霉素、青霉素G、四環(huán)素、林可霉素、慶大霉素的耐藥率都超過了50%，其中頭孢氨芐、復方新諾明、紅霉素、鏈霉素四種抗生素耐藥率都超過了90%，分離株對氟苯尼考和氧氟沙星敏感的比例分別為85.71%和80.95%。韓太武等從新疆石河子地區(qū)部分規(guī)?；i場采集并分離得到12株Pm（2014年），藥敏試驗顯示該菌對先鋒VI、氯霉素、環(huán)丙沙星敏感性較強，其耐藥率分別為83.3%、75%、75%，而該菌對紅霉素、慶大霉素、卡那霉素、青霉素、痢特靈、氨芐青霉素等其他幾種抗生素耐藥率較強，該菌對四環(huán)素的耐藥率為66.7%。陳光宏等（2009）從西寧豬場分離出8株Pm，用其中4株做藥敏試驗，結果顯示該菌對氯霉素、羧芐青霉素、鏈霉素、卡那霉素高度耐藥，對痢特靈、丁胺卡那2種抗生素敏感。王翠霞等(2014)在甘肅某地分離出豬源4株Pm，藥敏試驗判定結果為4個菌株均對β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素很敏感，對磺胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類、林可胺類和氯霉素類抗菌藥物具有一定的耐藥性；對四環(huán)素類和硝基呋喃類抗菌藥物高度耐藥。徐引弟等從河南各地豬場分離出35株Pm（2009年～2010年），選用了18種抗生素進行了藥敏試驗，結果顯示大部分Pm對氨芐西林、萬古霉素、新霉素、阿莫西林、克林霉素、鏈霉素、復方新諾明、慶大霉素、四環(huán)素、痢特靈等耐藥，所有Pm對頭孢噻呋、頭孢噻肟、氟苯尼考高度敏感，絕大部分Pm對環(huán)丙沙星、頭孢唑啉、頭孢他啶、氯霉素、強力霉素高度敏感。廖素環(huán)等(2011)選用了41種抗生素用于源自廣西的14株豬源Pm的藥敏試驗，實驗結果顯示，大多數(shù)菌株對磺胺類、硝基呋喃類和林可胺類抗菌藥的耐藥率比較高，均在79%以上。但對喹諾酮類和利福霉素類耐藥率相對比較低，均在57%以內(nèi)。菌株對氧呱嗪青霉素、頭孢噻肟、卡那霉素、氧氟沙星、諾沙星、左氟沙星、恩諾沙星、多粘菌素B和利福平這9種藥的耐藥率在2l%～36%之間。

從以上文獻中，可以看出我國Pm耐藥的幾個特點：（1）我國Pm耐藥情況很嚴重，上述文獻中全國各地區(qū)東、西部和北方、南方的Pm都表現(xiàn)出了耐藥性，整體呈多重耐藥，耐藥率偏高的特點。（2）各地區(qū)Pm對具體的某種抗生素的耐藥率差異性大，例如上述文獻中蘇中地區(qū)分離的Pm對頭孢氨芐的耐藥率為95.2%，甘肅、新疆、廣西相應的耐藥率分別為0%、16%、71%。（3）就上述文獻而言，各地區(qū)對鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、復方新諾明、四環(huán)素、林可霉素等抗生素耐藥率都比較高，而對氟苯尼考高度敏感。

2.2 國外部分地區(qū)豬源Pm及其他動物源Pm的耐藥性研究現(xiàn)狀

SwarajRajkhowa等在印度分離出44株豬源Pm，藥敏試驗結果表明所有菌株對氯霉素、金霉素、恩諾沙星、多西環(huán)素敏感，而大部分菌株對頭孢曲松、先鋒霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、諾氟沙星敏感；絕大部分菌株對頭孢氨芐、青霉素G、磺胺嘧啶耐藥，大部分菌株對卡那霉素、四環(huán)素耐藥。Mamta Tigga等人從印度恰蒂斯加爾邦分離出豬源Pm，并應用15種抗生素進行了藥敏試驗，結果顯示，該菌株對慶大霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、甲氧芐氨嘧啶、磺胺嘧啶高度敏感，對丁胺卡那霉素、復方新諾明較敏感，而對頭孢唑肟、頭孢氨芐、氯唑西林、羅紅霉素表現(xiàn)為高度耐藥。MarkowskaDanie等從波蘭豬場分離出45株Pm，藥敏試驗結果表明97%的菌株對幾乎所有的抗生素敏感，包括阿莫西林、泰妙菌素、β內(nèi)酰胺類如氨芐青霉素、頭孢菌素、強力霉素、泰樂菌素、四環(huán)素、慶大霉素、青霉素、新霉素等。ZomuankimaVarte等從Mizoram地區(qū)分離到15株Pm，所有菌株對氨芐青霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、復方新諾明、恩諾沙星、紅霉素、慶大霉素、氧氟沙星、利福平和四環(huán)素敏感，其余抗生素敏感度分別是土霉素（93%）緊隨其后，氨芐青霉素（87%）、丁胺卡那霉素（47%）。SellyeiB等在匈牙利分離出的56株Pm（包括20株禽源Pm，36株豬源Pm）對磺胺類、四環(huán)素、第一代喹諾酮類和氨基糖苷類抗生素較明顯耐藥，而對新的大環(huán)內(nèi)酯類(泰拉菌素)，第三代氟喹諾酮類(恩諾沙星)和第四代頭孢菌素(頭孢喹肟)較為敏感。ShionaK.Glass-Kaastra等監(jiān)測了加拿大安大略省大約1500株豬源Pm的耐藥性情況（1998～2010年），結果表明，41.5%的菌株至少對一種抗生素耐藥，17.1%的菌株至少對兩種抗生素耐藥。

從國內(nèi)外的相關研究可以看出，不同國家、不同地區(qū)的豬源多殺性巴氏桿菌對各種抗生素都出現(xiàn)了不同程度的耐藥性；加拿大、匈牙利、波蘭等歐美國家Pm耐藥性情況要好于我國，波蘭豬源Pm對幾乎所有抗生素敏感，一定程度上與發(fā)達國家更加先進的養(yǎng)殖技術和科學的用藥標準有關；我國大部分地區(qū)的Pm呈現(xiàn)出耐藥范圍廣、多重耐藥、耐藥率高的特點，多殺性巴氏桿菌表現(xiàn)出差異性的耐藥性可能跟不同地區(qū)應用的抗生素種類、用量、時間長短不同、使用頻率有關；某地區(qū)某種抗生素使用時間越長，則當?shù)豍m菌株對此種抗生素耐藥率越高，而一般情況下Pm對剛研發(fā)或者應用少的抗生素的耐藥率較低，這與Pm耐藥菌株的選擇性富集擴增或耐藥基因的轉移有關；同時也可能與不同地區(qū)Pm的血清型分布差異有關；從上述文獻可以看出我國大部分地區(qū)豬源Pm對四環(huán)素類、氨基糖苷類、青霉素類抗生素都產(chǎn)生較高的耐藥率，而對氟苯尼考等應用時間相對較短的抗生素較為敏感。

3 小結

從上述各文獻可以看出我國豬源Pm耐藥性形勢已不容樂觀，Pm的耐藥性可以看作是為適應環(huán)境而產(chǎn)生的自身進化的結果，其耐藥性的產(chǎn)生是不可避免的，但是我們可以通過正確處理抗生素的使用與耐藥性產(chǎn)生的關系來減緩這個過程；除了研究細菌的耐藥機機制與新的抗菌手段以外，合理應用抗生素、盡量減少亞治療濃度的預防性用藥始終是應對豬源Pm以及其他細菌耐藥的一個重要手段；不同地區(qū)的Pm耐藥性差異比較明顯，因此各地區(qū)分離Pm，并篩選出對當?shù)豍m菌株有效的抗生素，有助于防治豬多殺性巴氏桿菌病在本地區(qū)甚至全國范圍的流行。

[1]陸承平.獸醫(yī)微生物學（第4 版）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011.136-137.

[2]王翠霞,車小平.豬源多殺性巴氏桿菌分離鑒定及藥敏試驗[J].中國畜牧業(yè),2014,(17):57-58.

[3]Townsend, K. M., Boyce, J. D., Chung, J. Y., Frost, A. J., &Adler, B. (2001). Genetic organization of pasteurella multocida cap loci and development of a multiplex capsular PCR typing system. erratum: June 2001, v. 39 (6), p. 2378.]. Journal of Clinical Microbiology., 39(3) :924-929.

[4]孫建華,蔣惠婷,朱玉欣,等.豬多殺性巴氏桿菌環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立[J]. 中國預防獸醫(yī)學報,2014,36(12):957-960.

[5]Sun, D., Wang, J., Wu, R., Wang, C., He, X., Zheng, J., &Yang, H. Development of a novel LAMP diagnostic method for visible detection of swine pasteurella multocida. Veterinary Research Communications,2010, 34(8):649-57.

[6]韓太武,楊超,趙春光等.新疆石河子地區(qū)部分規(guī)?；i場豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].山東畜牧獸醫(yī),2014,(9):6-7,8.

[7]Rajkhowa, S., Shakuntala, I., Pegu, S. R., Das, R. K., &Das, A. Detection of pasteurella multocida isolates from local pigs of india by polymerase chain reaction and their antibiogram.TropicalAnimalHealthandProduction,2012,44(7):1497-503.

[8]Tigga,M.,Ghosh,R.C.,Malik,P.,Choudhary,B.K.,Tigga,P.,&Nagar,D.K.Isolation,characterization,antibiogram and pathologyofpasteurellamultocidaisolatedfrompigs.Veterinary World,2014,7(5):363-368.

[9]Markowska-Daniel,I.,Urbaniak,K.,Stepniewska,K.,&Pejsak,Z.Antibioticsusceptibilityofbacteriaisolatedfromrespiratorytractofpigsinpolandbetween2004and2008.Polish JournalofVeterinarySciences,2010,13(1):29-36.

[10]Varte,Z.,Dutta,T.K.,Roychoudhury,P.,Begum,J.,&Chandra,R.Isolation,identification,characterizationandantibiogramofpasteurellamultocidaisolatedfrompigsinmizoramwith specialreferencetoprogressiveatrophicrhinitis.Veterinary World,2014,7(2):95-99.