山茱萸總苷的提取工藝及藥理研究

孫志明 門秀麗

（河北聯(lián)合大學基礎醫(yī)學院，河北 唐山063000）

中藥山茱萸為我國傳統(tǒng)名貴中藥，有補肝腎，澀精氣，固虛脫之功效[1]，具有降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗休克、抗心律失常、抗菌、抗炎、抗癌、抗艾滋病、不育癥和治療骨質(zhì)疏松癥等藥理活性，其主要成分為環(huán)烯醚萜苷類、五環(huán)三萜酸及其酯類、鞣質(zhì)類、揮發(fā)油類及多糖類等[2-4]。作為主要藥效部位的山茱萸總環(huán)烯醚萜苷包括馬錢苷（loganin）、莫諾苷（morroniside）、獐牙菜苷（sweroside）、獐芽菜苦苷（swertiamarin）、馬鞭草苷（verbenalin）、脫水莫諾苷元、山茱萸新苷（cornuside）等十余種，統(tǒng)稱為山茱萸總苷(Total glucosides from Cornus officinalis，TGC)。本文對山茱萸總苷的提取工藝、含量測定、藥動學、藥效學的研究進展進行綜述。

1 提取工藝

中藥苷類的提取一般采用含乙醇的水溶液提取，純化則采用大孔吸附樹脂富集的方法。

梁晉如等[5]采用星點設計-響應面法優(yōu)化山茱萸總苷的提取及純化工藝。以乙醇濃度、液料比和提取時間為自變量，以莫諾苷、馬錢苷和獐牙菜苷的收率以及提取物得率為因變量，通過對自變量的總評歸一值進行多元線性回歸和二項式擬合，以響應面優(yōu)選最佳的超聲提取工藝。以乙醇濃度、洗脫體積、上樣量為自變量，以莫諾苷、馬錢苷和獐牙菜苷的收率以及洗脫物得率為因變量，通過對自變量的總評歸一值進行多元線性回歸和二項式擬合，以響應面優(yōu)選最佳的大孔樹脂純化工藝。確定提取工藝條件為乙醇濃度22%～25%，液料比12～15倍，提取時間30～40 min；純化工藝條件為乙醇濃度35%～45%，洗脫體積7～9 BV，上樣量40～50 mg/g。

不同型號的大孔樹脂對藥物的吸附程度不同。趙惠茹等[6]通過比較山茱萸總皂苷在9種不同型號大孔樹脂上的吸附與解吸性能篩選最佳樹脂，確定HPD-300型大孔樹脂具有良好的吸附與解吸性能，工藝參數(shù)為：上樣溶液質(zhì)量濃度為0.5 g/mL，樹脂柱徑高比為1:7，吸附體積流量為2BV/h，每克干樹脂的最大吸附量為1.125g生藥。吸附飽和后，先用3 BV蒸餾水洗脫去除水溶性雜質(zhì)，再用3.5 BV 50%乙醇進行解吸附，純化后的山茱萸總皂苷保留率和精制度分別為92.6%和394.5%。HPD-300型大孔樹脂可作為純化山茱萸總皂苷的較佳分離材料。

姬長新等[7]將山茱萸首先采用超高壓進行處理，然后將高壓處理后的山茱萸采用纖維素酶進行酶解提取，研究超高壓耦合纖維素酶處理對山茱萸得率的影響。結(jié)果表明，采用400MPa壓力處理3min，然后加入纖維素酶達到濃度1mg/mL，溫度55℃，pH4.5下酶解120min，山茱萸總皂甙的得率達到3.68%，是一種提取山茱萸總皂甙的新方法。

Liang J等采用高速逆流色譜法，選擇二氯甲烷-甲醇-正丁醇-水-乙酸（5:5:3:4:0.1，v/v/v/v/v）組成的兩相溶劑系統(tǒng)，不到3h就從100mg山茱萸提取物中分離純化得到 7.9mg獐牙菜苷，13.1mg莫諾苷和10.2mg馬錢苷共三種環(huán)烯醚萜苷，純度分別為92.3，96.3和94.2%。

2 含量測定

中國藥典（2010版）規(guī)定以測定馬錢苷的含量來控制山茱萸藥材的質(zhì)量，以乙腈-水(15：85)為流動相；檢測波長為240nm[1]。

李偉等建立反相高效液相色譜法測定山茱萸環(huán)烯醚萜總苷中馬錢苷和莫諾苷含量的方法，方法為Lichrosphere C18柱(4.6mm×150mm, 5μm)，流動相為乙腈-水梯度洗脫(0~12min，乙腈10%~55%)，檢測波長240nm。結(jié)果馬錢苷和莫諾苷分別在0.088~0.528μg（r=0.9998）和0.088~0.352μg（r=0.9995）之間線性良好，可以用于控制山茱萸環(huán)烯醚萜總苷的質(zhì)量。

Cai H等建立HPLC串聯(lián)電噴霧電離質(zhì)譜法同時測定山茱萸中莫諾苷、馬錢苷、獐芽菜苷、7-O-甲基莫諾苷、山茱萸新苷和沒食子酸等八種成分的含量，采用電噴霧離子源(ESI)正離子模式，Agilent Zorbax Extend C18色譜柱，可在 10min全部檢測完成，定量限 0.0042~ 12.7875ng/mL，平均回收率97.1~103.7%。

3 藥動學

中藥藥動學對闡明中藥的有效性、有效成分的作用機制、解釋中藥復方配伍的合理性及中醫(yī)的辨證施治等都有重要意義，同時還為新活性成分的發(fā)現(xiàn)、新藥合成及新的前體藥物的制備提供理論和實踐的依據(jù)。

山茱萸總苷中馬錢苷和莫諾苷的吸收、分布、代謝和排泄均有報道。如山茱萸注射液中馬錢苷和莫諾苷在小鼠體內(nèi)藥物代謝動力學研究，馬錢苷和莫諾苷均符合二室模型，主要藥動學參數(shù)t1/2(α)，t1/2(β)，k21，k12，k10，V，AUC，CL分 別 為 3.2，25.1min，6.0，4.98，3.56/h，0.551L/kg，13.6mg·h/L，1.96 L/kg·h；3.6，21.5min，5.93，3.83，3.80/h，0.647L/kg，27.2mg·h/ L，2.46L/kg·h。組織分布方面，馬錢苷在腎中藥物濃度最高，其次在胃、肺、小腸等組織，腦組織中最少。大多數(shù)組織的藥物含量于給藥后90 min最高，然后逐漸下降。莫諾苷在小腸中藥物濃度最高，其次在腎和胃等組織，心、肝、肺和脾中濃度較低，腦組織中未檢測到莫諾苷。馬錢苷在大鼠體內(nèi)的尿液排泄藥動學表明，24 h內(nèi)馬錢苷原型藥物經(jīng)尿排泄完全，排泄量主要集中在0~4 h，約占總排泄量的81.5%；莫諾苷在24h內(nèi)原型藥物經(jīng)尿排泄完全，排泄量主要集中在0~3 h，約占總排泄量的68.5%。馬錢苷可被腸道細菌酶水解生成苷元，苷元又進一步代謝轉(zhuǎn)化，生成代謝物Mlog-2，Mlog-2最終被排出體外。莫諾苷可被腸道細菌酶水解形成苷元，經(jīng)環(huán)裂解，與NH3發(fā)生親核加成后環(huán)化及脫水縮合等步驟生成代謝物Mmor-1，苷元經(jīng)環(huán)裂解，安息香縮合，與NH3發(fā)生親核加成后環(huán)化生成代謝物Mmor-2，Mmor-1和Mmor-2最終排出體外。

藥動學參數(shù)的處理方法除了傳統(tǒng)的3P97、DAS等以外，還可以采用BP神經(jīng)網(wǎng)絡預測莫諾苷的藥動學參數(shù)。

4 藥效學

山茱萸總苷對糖尿病的作用。以高脂飼養(yǎng)結(jié)合STZ腹腔注射造模，于造模后2周分別灌胃給予降糖通脈膠囊、山茱萸總苷（0.05、0.1、0.2 g/kg）治療，連續(xù)16周。結(jié)果顯示應用山茱萸總苷后，糖尿病大鼠血糖降低，血清NO、NOS水平升高，血漿ET水平降低，心指數(shù)降低，心肌肥大程度減輕，對糖尿病心臟病變有一定的保護作用。郭潔等采用巨噬細胞和腎系膜細胞共培養(yǎng)體系，確定山茱萸環(huán)烯醚萜總苷顯著抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)誘導的巨噬細胞遷移能力，不同劑量山茱萸環(huán)烯醚萜總苷(1.0、0.5、0.25 mg/mL)對巨噬細胞遷移抑制率分別為42.09%±7.25%、26.44%±10.23%、20.84%±6.84%；顯著抑制AGEs誘導的炎癥因子IL-6、IL-10、MCP-1和TNF-α的分泌水平；Western blot分析顯示山茱萸環(huán)烯醚萜總苷及AGEs受體特異性抗體顯著下調(diào)AGEs誘導的ICAM-1和TGF-β1的蛋白表達。山茱萸環(huán)烯醚萜總苷可劑量依賴性地減輕AGEs誘導的大鼠腎系膜細胞HBZY-1炎癥反應，對糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展具有一定的保護作用。Ma W等研究表明山茱萸中的苷類抑制體外高糖培養(yǎng)HRMCs的IV型膠原抗體、纖維連接蛋白和IL－6。目前已經(jīng)證實山茱萸總苷中的莫諾苷是降糖作用的主要有效成分。

山茱萸總苷有抗炎、免疫抑制作用。小鼠給予總苷2、1 g/kg劑量時能顯著地抑制NIH小鼠單核吞噬系統(tǒng)對剛果紅的廓清；1.00、0.50、0.25 g/kg以及4.0、2.0 g/kg各個劑量時能分別顯著抑制角叉菜膠所致小鼠及大鼠足爪腫脹；而在0.6、0.3 g/kg劑量時，能明顯抑制由弗氏完全佐劑誘導的關節(jié)炎所引起的注射局部的早期炎癥反應和12d后的再度腫脹，又明顯抑制另側(cè)后肢因遲發(fā)性超敏反應所引起的足腫脹。0.15 g/kg劑量時，連續(xù)給藥12 d后，表現(xiàn)出對再度腫脹及另側(cè)后肢腫脹的明顯抑制作用。證明了山茱萸總苷有良好的抗炎免疫作用。山茱萸總苷可以抑制T、B淋巴細胞增殖，抑制大鼠佐劑性關節(jié)炎的腹腔巨噬細胞產(chǎn)生TNFα、IL－1、IL－6等，具有免疫抑制作用。本研究結(jié)果表明山茱萸總苷可以明顯抑制rTNF－α和rIL－1誘導ECV304表達ICAM－1和CD44表達，并呈明顯的量－效關系，抑制血管內(nèi)皮細胞的活化表達ICAM－1和CD44可能是山茱萸總苷的免疫抑制機理的分子基礎之一。孟晶等建立封閉群大鼠SD－Wistar組間同種異體穿透性角膜移植模型，觀察脾淋巴細胞對絲裂原刀豆蛋白A刺激的增殖反應和單向混合淋巴細胞反應提出抑制T淋巴細胞的增殖、混合淋巴細胞反應、T淋巴細胞活化表達CD分子，IL－2受體的表達是山茱萸總苷抑制機體細胞免疫功能的主要機制之一。

山茱萸總苷抑制細胞凋亡的作用。陳克芳等采用原代培養(yǎng)乳鼠的心肌細胞，液狀石蠟封閉法建立缺血缺氧模型，將原代培養(yǎng)3d的心肌細胞分為對照組、缺氧組(1h、2h、3h、5h)及治療組，藥物濃度為生藥10g/L，TUNEL法檢測各組的凋亡率結(jié)果顯示，與對照組相比，缺氧組各時間點凋亡率明顯上升 (P＜0.01)，與缺氧組比較，治療組各個時間點的凋亡率都有所下降(P＜0.01)，山茱萸總苷可以抑制心肌細胞的凋亡。Park CH等證實莫諾苷抑制肝細胞凋亡。

山茱萸總苷對阿爾采末病的作用。褚燕琦等以山茱萸環(huán)烯醚萜苷與人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SKNSH細胞預孵育24h，再用岡田酸10 nmol/L與SKNSH細胞共孵育6h，用Westernblot方法觀察磷酸化和非磷酸化tau蛋白表達，用間接免疫熒光法觀察神經(jīng)細胞微管的變化。提示山茱萸環(huán)烯醚萜苷能夠抑制神經(jīng)細胞tau蛋白過度磷酸化，保護細胞微管結(jié)構(gòu)，因此可能具有治療Alzheimer病應用前景。

山茱萸總苷對腦梗死的作用。李林等將大鼠灌胃給予山茱萸提取物（主要成分為環(huán)烯醚萜苷）7d后，制作光化學致腦梗死模型，采用分光光度法檢測腦組織中NO和一氧化氮合酶（NOS）的變化，免疫組織化學方法檢測核轉(zhuǎn)錄因子κΒ陽性細胞數(shù)量的變化。結(jié)果顯示山茱萸環(huán)烯醚萜苷通過減小腦梗死面積，降低腦皮層NO含量和NOS活性，并顯著減少核轉(zhuǎn)錄因子κΒ陽性細胞數(shù)量發(fā)揮對腦梗死的治療作用。

山茱萸總苷促進坐骨神經(jīng)損傷再生及修復。齊爽等將84只Balb/ c小鼠隨機分為山茱萸總苷高、中和低劑量組及生理鹽水對照組，各組分別于術(shù)后3天、5天、1周、2周、4周、8周時間點采用免疫組化法檢測L4～L6脊髓運動神經(jīng)元內(nèi)生長相關蛋白(Gap－43)表達；術(shù)后第4、8、12周行電生理檢查測定神經(jīng)傳導速度(MCV)。結(jié)果顯示高、中劑量組Gap－43表達明顯多于低劑量和對照組(P＜0.05)，術(shù)后第4、8、12周高、中劑量組較低劑量組和對照組再生神經(jīng)傳導速度加快、波幅升高、潛伏時縮短(P＜0.05)。山茱萸總苷能夠促進大鼠周圍神經(jīng)損傷后MCV的恢復，其機制可能為增加損傷脊髓運動神經(jīng)元中Gap－43的表達。

山茱萸總苷對干細胞的作用。人骨髓間充質(zhì)干細胞(hMSCs)是一種被認為具有多種分化潛能的細胞，在特定條件下能夠分化為脂肪細胞、造骨細胞、肌腱細胞和造血基質(zhì)細胞等多種細胞，用于細胞治療和基因治療，可能會成為治療Ⅰ型糖尿病的有效手段。Hu N等證實莫諾苷促進骨髓間充質(zhì)干細胞(RMSC)增殖。

5 結(jié)語

山茱萸總苷在提取工藝、藥動學及藥效學方面的研究日漸成熟，我國山茱萸資源豐富，如果將山茱萸總苷設計成合理的劑型，研發(fā)療效確切的新藥，必將有著廣闊的臨床應用前景和生產(chǎn)前景，對開發(fā)我國中藥資源有著重要意義。

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