席夫堿Ru（Ⅲ）配合物的合成及其與DNA的相互作用

余光勤，宋文婷，袁澤利，胡慶紅，吳 慶，張銘欽，江 波

（遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 遵義563003）

金屬配合物因其在醫(yī)藥領(lǐng)域有著巨大的潛在藥用價(jià)值而引起藥物化學(xué)研究者的長期關(guān)注［1－2］。如已成功應(yīng)用于臨床的鉑類藥物對DNA結(jié)構(gòu)造成損傷的作用機(jī)制，迄今為止沒有任何有機(jī)藥物可以模仿；此外，由于金屬配合物具有不同的配位數(shù)和幾何構(gòu)型以及不同的熱力學(xué)與動力學(xué)特性，易產(chǎn)生不同的氧化還原態(tài)，可利用其實(shí)現(xiàn)化學(xué)治療與光動力治療的雙治療功能［3］。鉑類配合物型抗腫瘤藥物臨床應(yīng)用廣泛，而此類抗腫瘤藥物易產(chǎn)生毒副作用（如神經(jīng)毒性、肝毒性、腎毒性、耳毒性、骨髓毒性等）［3］，嚴(yán)重制約了其實(shí)際療效和適用范圍，因此，人們繼而研究具有不同作用機(jī)理的新型金屬配合物用于抗癌藥物篩選。

釕配合物作為非鉑系金屬配合物，已有文獻(xiàn)報(bào)道了其低毒、易吸收及排泄快等特點(diǎn)［4］；此外，釕配合物還具有易被腫瘤組織吸收的特性［5］。因而，釕配合物是國際公認(rèn)的最具發(fā)展?jié)摿Φ倪^渡金屬配合物，有望成為繼鉑類配合物后的抗腫瘤活性高、毒性低的金屬配合 物 型 抗 腫 瘤 藥 物［4，6］。釕 配 合 物 ［HIm］［trans－RuCl4（DMSO）（Im）］（NAMI－A）和 ［HIm］［trans－RuCl4（Im）2］（KP1019）成功進(jìn)入抗腫瘤臨床試驗(yàn)［7－8］，極大地激發(fā)了研究者們對釕配合物的研究熱情［9－10］。金屬配合物與生物大分子，尤其是與DNA相互作用的方式和機(jī)理，可為抗癌前藥的初步篩選提供有用的信息，也有助于從分子水平了解抗癌藥物的作用機(jī)理，為設(shè)計(jì)、合成低毒、高效的抗癌藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，使藥物的初步篩選更加有效［11］。因此，設(shè)計(jì)、合成金屬配合物分子并研究其與DNA的相互作用具有重要意義。

席夫堿類配合物因具有許多優(yōu)良的生物活性（如抑菌、殺菌、抗腫瘤、抗病毒等），其與生物大分子相互作用的研究多年來備受關(guān)注［12－14］。鑒于此，作者設(shè)計(jì)、合成具有席夫堿配體的Ru（Ⅲ）配合物（合成路線見圖1），并在模擬生理?xiàng)l件（pH＝7．40）下，通過熒光光譜法研究其與鯡魚精DNA的相互作用，探討它們之間的結(jié)合方式，以期為后續(xù)有關(guān)研究奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1．1 試劑與儀器

三羥甲基氨基甲烷（Tris）、吖啶橙（AO）、鯡魚精DNA、間苯二甲胺、2－羥基－1－萘甲醛、三氯化釕，百靈威試劑公司，均未經(jīng)處理直接使用；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

北京譜析TU－1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)；美國奧立龍868型pH計(jì)；德國Vario ELⅢ型元素分析儀；美國 Varian 1000型紅外光譜儀；德國 MS HP－1100型質(zhì)譜儀；美國 Agilent－400DD2型核磁共振儀；上海儀電雷磁DDS－307型電導(dǎo)率儀。

圖1 席夫堿Ru（Ⅲ）配合物（L－Ru）的合成Fig．1 Synthetic route of Schiff base Ru（Ⅲ）complex（L－Ru）

1．2 配體（H2L）和配合物（L－Ru）的合成

稱取0．81g（6mmol）間苯二甲胺溶于75mL無水甲醇中，再加入2．36g（14mmol）2－羥基－1－萘甲醛，溶解后加熱回流4h，冷卻，用無水乙醇洗滌2～3次，真空干燥，得黃色固體即配體（H2L），產(chǎn)率63．26%。

在50mL圓底燒瓶中加入0．87g（2mmol）H2L和25mL無水乙醇，溶解后緩慢滴加含0．52g（2 mmol）三氯化釕的乙醇溶液20mL（30min內(nèi)滴完），加熱回流1h，冷卻后置于冰箱中過夜，抽濾，用少量的冰無水乙醇洗滌，真空干燥，得黑色粉末固體即配合物（L－Ru），產(chǎn)率31．33%。

1．3 H2L和L－Ru的表征

采用1HNMR、13CNMR、FTIR、MS及元素分析對H2L和L－Ru的結(jié)構(gòu)及組成進(jìn)行表征。

1．4 L－Ru與鯡魚精DNA的相互作用研究

1．4．1 溶液配制

DNA溶液用Tris－HCl緩沖液（pH＝7．40）配制，置于0～5℃冰箱中，備用。經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)測定其A260／A280大于1．8，說明該溶液純度滿足實(shí)驗(yàn)要求，基本不含蛋白質(zhì)；根據(jù)其在260nm波長處的吸收系數(shù)6 600L·mol－1·cm－1可確定其濃度為2．409×104mol·L－1。

其余溶液用Tris－HCl緩沖液（pH＝7．40）按濃度要求配制，置于0～5℃冰箱中，備用。

紫外測試中以pH＝7．40的Tris－HCl緩沖液為空白。

1．4．2 L－Ru與鯡魚精DNA的相互作用及熱力學(xué)參數(shù)測定

考察在298K和308K下L－Ru溶液濃度對DNA的影響。在DNA溶液濃度不變的情況下，分別加入不同體積的L－Ru溶液，將L－Ru－DNA體系分別置于298K和308K的恒溫水浴箱中反應(yīng)20min，以pH＝7．40的Tris－HCl緩沖液為空白，測定其熒光光譜，并計(jì)算其熱力學(xué)參數(shù)。

1．4．3 L－Ru對 AO－DNA體系熒光光譜的影響

以與DNA具有嵌插作用的典型化合物吖啶橙（AO）為探針，用pH＝7．40的 Tris－HCl緩沖液定容至刻度，搖勻，于298K的恒溫水浴箱中反應(yīng)20min，以pH＝7．40的Tris－HCl緩沖液為空白，測定其熒光光譜，考察L－Ru與AO對DNA的競爭性。

1．4．4 NaCl、Na3PO4對 L－Ru－DNA 熒光光譜的影響

向一定濃度的L－Ru－DNA體系中分別加入一定量的NaCl或Na3PO4，于298K的恒溫水浴箱中反應(yīng)20min，以pH＝7．40的 Tris－HCl緩沖液為空白，測定其熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2．1 H2L和L－Ru的表征

H2L：1HNMR（CDCl3），δ：14．776（s，2H，OH），8．92（s，2H，CH＝N），6．95～7．91（m，16H，Ar－H），4．83（s，4H，－CH2－）；13CNMR（CDCl3），δ：158．78，137．71，136．64，133．26，129．03，127．75，126．89，126．39，123．55，122．77，117．97，57．73；FTIR（KBr），ν，cm－1：3 550，3 130，2 989，1 618，1 586，1 498，786；Anal．Calcd．for C30H26N2O2：C 80．69，H 5．87，N 6．27；Found C 80．63，H 5．95，N 6．18；MS（ESI），m／z：448［M＋H］＋。

1HNMR中，在δ8．9～9．0之間為席夫堿典型CH＝N質(zhì)子化學(xué)位移，說明了席夫堿的生成［15］，而在FTIR中的1 618cm－1更進(jìn)一步證實(shí)了這一官能團(tuán)的生成［15］。

L－Ru：FTIR（KBr），ν，cm－1：3 150，1 625，1 595，1 500，785；Anal．Calcd．for C30H22N2O2Cl2Ru·2H2O：C 55．39，H 4．03，N 4．56；Found C 55．53，H 4．25，N 4．29；MS（ESI），m／z：580［M－2H2O－Cl－＋H］；Λm［（H2O∶DMSO）＝1∶5（體積比），1．0×10－5mol·L－1，Ω－1·mol－1·cm2］：8．7。

結(jié)合質(zhì)譜和元素分析結(jié)果，可以說明L－Ru的生成。此外，L－Ru的摩爾電導(dǎo)率很小，說明L－Ru中的Cl－與中心金屬離子以配位形式而非離子形式存在，其為非電解質(zhì)［16］。

2．2 L－Ru與鯡魚精DNA的相互作用考察

2．2．1 L－Ru與鯡魚精DNA的相互作用及熱力學(xué)參數(shù)的測定

1）L－Ru與DNA的熒光光譜

熒光光譜是研究配合物與DNA相互作用的最常見和簡便的方法［17］。如果配合物與DNA作用后出現(xiàn)了熒光增強(qiáng)或減弱現(xiàn)象，說明配合物與DNA發(fā)生了一定的作用。雖不能以此作為配合物與DNA發(fā)生嵌插或其它作用的直接判據(jù)，但熒光變化幅度的大小可反映出配合物與DNA之間是否發(fā)生作用及其作用的強(qiáng)弱。圖2為L－Ru與DNA作用前后的熒光光譜圖。

由圖2可以看出，隨著L－Ru的加入，DNA在551 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，說明L－Ru與DNA之間能夠發(fā)生作用。

2）結(jié)合常數(shù)與熱力學(xué)函數(shù)的測定

熱力學(xué)函數(shù)可以考察化學(xué)反應(yīng)在一定條件下能否發(fā)生。因此，通過考察吸光度與DNA濃度的關(guān)系（式1）［18］，確定L－Ru能否與鯡魚精DNA發(fā)生相互作用。

圖2 不同濃度L－Ru與DNA的熒光光譜Fig．2 Fluorescence spectra of DNA in the presence of L－Ru at different concentrations

式中：A0和A分別表示DNA加入前后體系的吸光度；K為DNA與L－Ru的結(jié)合常數(shù)；c為DNA的濃度，μmol·L－1。

本實(shí)驗(yàn)分別對298K和308K時在260nm處測定的相對吸收強(qiáng)度按式（1）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以1／（A0－A）對1／c作圖，結(jié)果見圖3。

圖3 在298K（a）和308K（b）下DNA體系在260nm處1／（A0－A）對1／c的雙倒數(shù)曲線Fig．3 Double reciprocal curve of 1／（A0－A）vs 1／c for DNA system at 260nm in 298K（a）and 308K（b）

由 圖 3 得 到 1／KD，298K＝3．0925×10－5mol·L－1、1／KD，308K＝3．1046×10－5mol·L－1，因此，結(jié)合常數(shù)分別為 KD，298K＝3．234×104L·mol－1、KD，308K＝3．221×104L·mol－1。

結(jié)合熱力學(xué)公式，有：

根據(jù)式 （2）、式 （3）可 計(jì) 算：298K 時，L－Ru 與DNA反應(yīng)的焓變 ΔrHθm，298K＝45．50kJ·mol－1、自由能 ΔrGθm，298K＝－25．73kJ·mol－1及熵變 ΔrSθm，298K＝0．23J·mol－1·K－1。由此可判定 L－Ru能與 DNA自發(fā)發(fā)生相互作用，且這種作用為熵與焓共同驅(qū)動所致。

2．2．2 AO對L－Ru－DNA體系的熒光光譜的影響

研究表明，AO系共軛稠環(huán)剛性平面分子，是一種堿性染料，能與DNA的雙螺旋堿基對之間發(fā)生專一的嵌插作用［19］，因而常常用作核酸的光譜探針。AO本身熒光性很弱，當(dāng)與DNA作用后，由于生色團(tuán)嵌插入堿基對中使其熒光性大大增強(qiáng)，在525nm處產(chǎn)生非常強(qiáng)的熒光信號。若某化合物與DNA發(fā)生了類似于AO與DNA的嵌插作用，在溶液體系中就會出現(xiàn)競爭，從而使得AO－DNA體系在525nm處的熒光強(qiáng)度發(fā)生變化，因而AO－DNA體系的熒光強(qiáng)度變化常常被用作判斷某化合物是否與DNA發(fā)生嵌插的作用標(biāo)志之一［19］。此外，傳統(tǒng)的EB探針有致癌性、對環(huán)境污染大，故采用低毒的AO作為探針研究L－Ru與DNA的相互作用。

AO對L－Ru－DNA的熒光光譜的影響如圖4所示。

圖4 AO對L－Ru－DNA體系熒光光譜的影響Fig．4 Effect of AO on fluorescence spectra of L－Ru－DNA

由圖4可以看出，L－Ru－DNA體系在551nm處有最大熒光發(fā)射峰，隨著AO的逐漸加入，在525nm處出現(xiàn)了新的熒光發(fā)射峰，該峰為AO與DNA的典型峰［20－21］。且551nm處的熒光發(fā)射峰沒有隨著 AO的加入而完全消失，表明L－Ru與DNA具有較強(qiáng)的嵌插作用，即使與DNA具有很強(qiáng)的嵌插作用的AO也未能完全將其從DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中擠出。

2．2．3 NaCl、Na3PO4對L－Ru－DNA熒光光譜的影響

為了進(jìn)一步考察L－Ru與DNA之間是否存在靜電作用，以強(qiáng)電解質(zhì)NaCl和Na3PO4考察離子強(qiáng)度的增加對L－Ru與DNA之間的熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 NaCl和Na3PO4對L－Ru－DNA體系熒光光譜的影響Fig．5 Effect of NaCl and Na3PO4on fluorescence spectra of L－Ru－DNA

由圖5可以看出，在開始加入NaCl時，體系熒光強(qiáng)度略有變化，繼續(xù)加大離子強(qiáng)度時，熒光強(qiáng)度幾乎未發(fā)生變化；體系中額外加入的磷酸根幾乎沒有引起體系熒光強(qiáng)度變化。說明L－Ru不與DNA的磷酸基團(tuán)等負(fù)電荷基團(tuán)發(fā)生靜電作用，也證實(shí)了L－Ru確實(shí)不與DNA發(fā)生靜電作用［22］。

3 結(jié)論

采用直接合成法合成了一個新的席夫堿Ru（Ⅲ）配合物，并利用1HNMR、13CNMR、FTIR、MS及元素分析等手段對其結(jié)構(gòu)和組成進(jìn)行表征。在模擬生理?xiàng)l件下，以吖啶橙為光譜探針，采用熒光光譜法考察LRu與鯡魚精DNA的作用機(jī)制。結(jié)果表明，L－Ru與DNA之間能夠自發(fā)地發(fā)生作用，這種作用是由熵與焓共同驅(qū)動而發(fā)生的嵌插作用。

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