金花茶遺傳多樣性研究進展

莫杰姝，曾 進 ，甘春雁，盧成陽

(1.廣西大學(xué)，廣西南寧 530004;2.廣西省南寧市金花茶公園，廣西南寧 530022;3.廣西省南寧青秀山風景名勝旅游開發(fā)有限責任公司，廣西南寧 530029;4.廣西省欽州市海洋局，廣西欽州 535000)

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是生命進化和物種分化的基礎(chǔ)，有廣義和狹義的定義之分［1］。廣義的遺傳多樣性是指地球上所有儲存在生物個體基因之中的各種遺傳信息的總和;狹義的遺傳多樣性是指生物種內(nèi)顯著不同的種群之間以及同一種群內(nèi)不同個體之間的遺傳變異總和［1］。因此，對遺傳多樣性的研究可以更好地了解物種種間及種內(nèi)群體間遺傳結(jié)構(gòu)的動態(tài)分布和多態(tài)性水平，對物種起源、種源區(qū)劃、品種鑒定、良種選優(yōu)、合理開發(fā)及利用、就地保護和遷地保護物種種質(zhì)資源等具有十分重要的指導(dǎo)意義。

金花茶屬國家一級珍稀保護植物，具有極高的觀賞價值、營養(yǎng)價值和藥用價值等，被世界譽為神奇的東方神茶、“植物界的熊貓”以及“茶族皇后”。因其具有極高的觀賞價值、營養(yǎng)價值和藥用價值，對金花茶的研究越來越多，從地理分布區(qū)域［2-4］、繁殖方式(扦插繁殖、壓枝繁殖、組織培養(yǎng))［5-14］、引種馴化［15-18］、化學(xué)成分［19-23］、藥用價值［24-27］到遺傳多樣性等的研究，金花茶越來越多的潛能被發(fā)現(xiàn)。筆者主要從形態(tài)學(xué)水平、細胞學(xué)水平、生化水平以及分子水平4個方面對金花茶遺傳多樣性研究進展進行概述，為今后金花茶的資源保護、開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

1 金花茶品種

金花茶(Camellia chrysantha)首次于1960在我國廣西被發(fā)現(xiàn)，目前世界上已知的金花茶有42種5變種，分布最多的位于廣西南部及西南部，產(chǎn)29種5變種;其次是越南北部，產(chǎn)10種，其余分布于我國云南、貴州、四川，各產(chǎn)1種［28］(表1)。

2 金花茶的遺傳多樣性研究

2.1 形態(tài)學(xué)水平 形態(tài)學(xué)標記遺傳多樣性研究是指通過利用植物的外部特征特性來檢測植物遺傳變異的一種既簡便易行又快速的方法，此方法主要是根據(jù)表型上的差異，如株高、株型、花色、花型、葉型等所表現(xiàn)出來的差異來反映基因型上的差異。而通過表型性狀來研究的遺傳多樣性，通常表現(xiàn)為符合孟德爾遺傳規(guī)律的單基因性狀，以及多基因決定的數(shù)量性狀。對植物種植資源的分類、鑒定和育種材料的選擇通常是依據(jù)表型性狀來開展研究的。但表型性狀在生長發(fā)育階段易受到外界因素的影響，且表現(xiàn)的數(shù)量極其有限，因此，此種方法對植物種植資源更深層次、更細化的研究具有很大的局限性［29］。

葉創(chuàng)興等［30］根據(jù)表型分類把倒卵金花茶作為檸檬金花茶的同物異名;張宏達［31］的分類標準將隴瑞金花茶和毛籽金花茶定義為大弄崗金花茶的同物異名。張宏達［31］和梁盛業(yè)［32］均認為防城金花茶和長柱金花茶是金花茶的同物異名，且認為防城金花茶是指亮葉離蕊茶，長柱金花茶則是亮葉離蕊茶的變種。湯忠皓［33］根據(jù)金花茶的花型大小、花部結(jié)構(gòu)、花瓣顏色、光澤以及花期等對19個目前已被發(fā)現(xiàn)定名以及未定名的金花茶進行分類。葉泉清等［34］認為將弄崗金花茶、毛籽金花茶、隴瑞金花茶、中華五室金花茶、直脈金花茶、多瓣金花茶、武鳴金花茶歸并為淡黃金花茶一個種的處理方法并不恰當，他們以花瓣合生高度、花色特征、子房室數(shù)、果皮厚度、種皮是否被毛、葉質(zhì)及厚度與側(cè)脈關(guān)系等作為主要分類性狀，將毛籽金花茶、隴瑞金花茶處理為弄崗金花茶的異名，把直脈金花茶、多瓣金花茶處理為中華五室金花茶的異名，而武鳴金花茶為獨立種。吳洪明［35］運用生理指標測定福建金花茶組植物的耐寒性，表明金花茶‘金壇洛’耐寒性較強，大弄崗金花茶‘金隴瑞’稍差。戴月等［36］通過對頂生金花茶和平果金花茶在分布、形態(tài)特征、物候期等方面進行觀察，發(fā)現(xiàn)這2種金花茶在這幾個方面均有明顯的差別，且認為頂生金花茶為平果金花茶的變種并不合適，主張頂生金花茶和平果金花茶為2個獨立種。

2.2 細胞學(xué)水平 細胞學(xué)標記多樣性主要是染色體多樣性，即根據(jù)細胞染色體核型及帶型特征進行的一種遺傳多樣性研究方法［37］。染色體是遺傳物質(zhì)的載體，是基因的攜帶者，因此染色體變異必然會在生物進化過程中導(dǎo)致遺傳變異。而檢測染色體是否變異，主要是研究植物特定的細胞學(xué)特征，如染色體的缺失、易位、倒位、重復(fù)或是染色體數(shù)目非整倍體的單體、三體、多體等。即表現(xiàn)為染色體核型，即染色體的數(shù)目、大小、隨體、著絲點位置等，以及帶型如C帶、N帶、G帶等方面的變異。隨著常規(guī)染色體技術(shù)、細胞原位雜交技術(shù)等染色體研究技術(shù)的不斷發(fā)展走向成熟，因此從細胞學(xué)水平上更能表達出植物的遺傳多樣性，且優(yōu)于形態(tài)變異［38］。

表1 金花茶品種

目前對金花茶染色體組型、核型的研究越來越多，如梁盛業(yè)［39］進行金花茶組植物(20種和3變種)核型的比較，黃錦培等［40］對金花茶染色體組型的觀察，金花茶染色體數(shù)目2n=30;盧天玲等［41］對金花茶和顯脈金花茶染色體數(shù)目和形態(tài)進行比較，結(jié)果表明兩者核型之間差異明顯。廖漢刃等［42］對蘋果金花茶、弄崗金花茶、夏石金花茶、小金花茶、倒卵金花茶和小金花茶的花粉染色體進行觀察，結(jié)果表明這6種金花茶的花粉染色體數(shù)目均相同，N=15，且蘋果金花茶花粉的核型公式K(n)=11m+3sm+1st，與金花茶、顯脈金花茶、凹脈金花茶、毛瓣金花茶和小果金花茶的核型具有顯著差異［43］。廖漢刃等［44］對凹脈金花茶、顯脈金花茶、金花茶、小金花茶的核型進行比較，結(jié)果表明顯脈金花茶是這4種金花茶種最原始的種，從染色體的相對長度變化而言，金花茶與小金花茶的核型存在較大差異。秦新民等［45］在1992年對防城金花茶和金花茶的核型進行比較，其核型公式分別為2n=2x=30=20m(2SAT)+10sm;2n=2x=30=22m(2SAT)+8sm，從核型的差異結(jié)合形態(tài)特征、花粉形態(tài)的不同，認為防城金花茶作為金花茶的變種是合理的。而在1993年研究了弄崗金花茶、隴瑞金花茶、武鳴金花茶和凹脈金花茶4種金花茶的核型，其中弄崗金花茶、弄崗金花茶和武鳴金花茶的核型相同［46］。王任翔等［47］對金花茶組的核型進行比較，結(jié)果顯示這7種金花茶間核型存在明顯差異。

2.3 生化水平 生化標記多樣性主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)多樣性，即從貯藏蛋白、同工酶等的變異分化來鑒定物種之間、品種之間是否存在遺傳差異，亦是鑒定外源DNA和物種起源進化的一種有效而廣泛應(yīng)用的遺傳多樣性研究方法［38］?；蛲ㄟ^控制蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來控制性狀，因此蛋白質(zhì)是基因的體現(xiàn)者，外界因素的差異以及植物本身因素的差異導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而轉(zhuǎn)錄成多種蛋白［48］。同工酶是指生物體內(nèi)因編碼基因不同而產(chǎn)生的多種分子結(jié)構(gòu)的酶，而對同工酶的分析也主要是從蛋白質(zhì)分子水平上進行研究，根據(jù)同工酶分子的大小、構(gòu)象、帶電荷數(shù)的不同，在電場中運動速度的不同以及形成譜帶數(shù)目、遷徙率的不同，進而直接鑒定生物群體內(nèi)物種之間、同一物種不同品種間的遺傳差異［37］。因其成本低，所需試驗技術(shù)較簡單，結(jié)果易于比較，準確性高，受外界環(huán)境影響較小等優(yōu)點，在植物遺傳多樣性研究中被廣泛應(yīng)用。

目前從生化水平上對金花茶的研究仍極少。1998年，梁機等［49］對8種金花茶植物的葉片可溶性蛋白質(zhì)進行研究，結(jié)果將8種植物聚類成5類:金花茶與防城金花茶;毛籽金花茶與弄崗金花茶;東興金花茶與平果金花茶;顯脈金花茶;毛瓣金花茶，從而體現(xiàn)出這8種金花茶親緣關(guān)系的遠近。

2.4 分子水平 分子標記多樣性研究直接體現(xiàn)在對DNA分子的研究上。DNA是組成遺傳基因的主要材料，也稱“遺傳微?！?。因此對遺傳信息，即DNA的堿基序列進行比較分析，能夠更直接地反映植物間的遺傳差異［38］。相對形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)、生化鑒定方法而言，DNA分子水平遺傳多樣性研究具有直接快速、多態(tài)性高、準確性高、特異性強、信息量大、微量分析、不存在上位性效應(yīng)，以及不受自身生長發(fā)育狀況、環(huán)境條件等因素的影響等優(yōu)點，是目前研究生物遺傳多樣性最理想的方法。該技術(shù)也被逐漸應(yīng)用于金花茶的遺傳多樣性研究、群體遺傳結(jié)構(gòu)研究、種間親緣關(guān)系研究等領(lǐng)域。目前應(yīng)用較多的分子標記技術(shù)主要有AFLP、ISSR、RAPD、RFLP、SSR以及ITS序列分析技術(shù)等。

2.4.1 AFLP。AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，擴增片段長度多態(tài)性)指對DNA限制性酶切片段進行選擇性擴增［50］。具有所需DNA樣品數(shù)量少，多態(tài)性強，位點多，穩(wěn)定性好，重復(fù)性強等優(yōu)點，但目前應(yīng)用于金花茶遺傳多樣性分析研究仍較少。

唐紹清等［51］運用AFLP分子標記方法對金花茶組23個種進行分析，結(jié)果表明薄葉金花茶、小花金花茶、夏石金花茶和小瓣金花茶之間的親緣關(guān)系很近，且同時驗證了毛籽金花茶、隴瑞金花茶、弄崗金花茶和大樣弄崗金花茶歸并到淡黃金花茶組是正確的。賓曉蕓［52］運用AFLP技術(shù)對我國分布區(qū)的6個金花茶自然居群的遺傳多樣性研究，揭示了金花茶物種均具有較高的遺傳多樣性水平，遺傳變異主要存在于居群間。

2.4.2 ISSR。ISSR 分子標記(Inter simple Sequence Repeats，簡單重復(fù)序列區(qū)間多態(tài)性)是在微衛(wèi)星分子標記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種分子標記［53］，其基本原理與SSR相似，但在引物設(shè)計上比SSR相對簡單，直接可用引物進行擴增，在提供遺傳信息方面更優(yōu)于RFLP、RAPD、SSR。目前被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、基因定位、構(gòu)建遺傳圖譜、種質(zhì)資源鑒定等方面的研究。

2005年，賓曉蕓等［54］采用ISSR分子標記對金花茶4個自然分布居群的遺傳多樣性進行研究，結(jié)果表明金花茶總體的遺傳多樣性水平較高，但居群內(nèi)的遺傳多樣性相對較低，遺傳變異主要存在于居群間，與運用AFLP分子標記技術(shù)研究結(jié)果相同。2014年，柴勝豐等［55］采用ISSR分子標記對毛瓣金花茶6個自然居群的遺傳多樣性進行分析，結(jié)果表明毛瓣金花茶在物種水平和居群水平上都表現(xiàn)出相對較高的遺傳多樣性，且毛瓣金花茶的遺傳變異主要存在于居群內(nèi)，居群間的遺傳分化程度較低。肖政等［56］采用ISSR分子標記技術(shù)對南寧金花茶公園金花茶組29份樣品進行遺傳多樣性分析，表明金花茶組物種的遺傳基礎(chǔ)較寬，并將29份金花茶樣品進行聚類分成三大類，即扶綏中東金花茶為一類，頂生金花茶和龍州金花茶為一類，其余金花茶聚為一類，其中夏石金花茶和小花金花茶的遺傳相似系數(shù)最高，弄崗金花茶和毛籽金花茶有著很近的親緣關(guān)系，與唐紹清等［57］研究結(jié)果相同。韋霄等［58］對遷地保護的3個人工栽培金花茶居群進行遺傳多樣性研究，結(jié)果表明遷地保護相較野生居群而言，仍能夠較好地保護金花茶的遺傳多樣性水平，且遷地保護的金花茶存在于居群內(nèi)的基因遺傳多樣性的概率遠高于居群間。

2.4.3 RAPD。RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)與PCR的反應(yīng)原理相同，即以待測基因組DNA片段作為模板，以堿基順序隨機排列的寡聚核苷酸(8～10個堿基)作為引物，通過PCR擴增，產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，從而進行多態(tài)性分析［59］。RAPD雖然具有DNA樣品數(shù)量少，操作技術(shù)簡單，檢測簡便且速度快，靈敏度高，特異性強等特點，但RAPD的重復(fù)性較差，且表現(xiàn)為顯性遺傳，存在共遷移問題［57］。

施蘇華等［60］運用RAPD分子標記技術(shù)對11種金花茶物種進行了分析，表明小花金花茶、扶綏金花茶和中東金花茶之間的親緣關(guān)系較近;大樣金花茶、薄葉金花茶和夏石金花茶之間的關(guān)系較近，龍州金花茶、毛籽金花茶、隴瑞金花茶和弄崗金花茶之間的關(guān)系亦較近;而凹脈金花茶為單獨種，與其他金花茶種親緣關(guān)系相對較遠。賓曉蕓等［54］運用RAPD分子標記對6個金花茶自然居群的遺傳多樣性研究，較AFLP、ISSR分子標記技術(shù)研究結(jié)果的遺傳多樣性指數(shù)略高，均能揭示了這6種金花茶的遺傳多樣性水平較高。

2.4.4 SSR。SSR 分子標記(Simple Sequence Repeats，簡單序列重復(fù))亦稱微衛(wèi)星DNA，是一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)。通過直接檢測顯示不同基因型個體在SSR位點的多態(tài)性來分析和鑒別生物體內(nèi)在核苷酸的排布和其表型顯現(xiàn)的規(guī)律，從而達到分析其遺傳多樣性的目的［57］。

唐健民［61］運用SSR分子標記對4個東興金花茶野生居群進行遺傳多樣性研究，表明東興金花茶的遺傳多樣性較高，遺傳分化主要存在于居群內(nèi)部，且子代野生居群的多樣性參數(shù)高于母代居群。徐晶等［62］運用SSR技術(shù)進行了6個以金花茶為母本，七星白、茶梅品種為父本的所有可能雜交種的鑒定，結(jié)果顯示除H2外所有可能的雜交種均來自于相應(yīng)父母本的真雜種，與母本是否來自于不同的金花茶個體關(guān)系不大。

2.4.5 ITS。ITS(Internal Transcribed Spacer，核糖 rRNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))指在rDNA基因中，由18S區(qū)、ITS1區(qū)、5.8S區(qū)、ITS2區(qū)和28S區(qū)頭尾串聯(lián)構(gòu)成的重復(fù)序列。ITS序列基因片段具有極大的保守性，亦能表現(xiàn)出極為廣泛的序列多態(tài)性，因此能實質(zhì)地反映出屬間和種間的堿基對微小的差異，目前已被廣泛應(yīng)用于菌類分類鑒定、植物種質(zhì)資源鑒定以及親緣關(guān)系非常近的物種或種群分類鑒定等方面［61］。

唐紹清等［57］運用ITS區(qū)序列對分布于我國的22個金花茶組物種進行測定，結(jié)果顯示淡黃金花茶、毛籽金花茶、隴瑞金花茶、弄崗金花茶、大樣金花茶和凹脈金花茶的親緣關(guān)系很近，小瓣金花茶、小花金花茶、薄葉金花茶、多瓣金花茶、夏石金花茶和龍州金花茶的親緣關(guān)系也較近。

3 展望

目前，在國內(nèi)從形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)、生化水平以及DNA分子水平上均涉及了對金花茶遺傳多樣性的研究，揭示了金花茶具有豐富的遺傳多樣性，為今后金花茶種質(zhì)資源的基因改良、育種選優(yōu)、遷地保護、開發(fā)及利用等方面的研究提供重要的理論依據(jù)。但在金花茶的遺傳多樣性研究中仍存在一些不足:①雖然對金花茶遺傳多樣性已進行相關(guān)研究，但研究的范圍并不夠全面，在表型、染色體、蛋白質(zhì)、同工酶方面的研究極少;②在DNA分子水平上對金花茶遺傳多樣性的研究多采用AFLP、ISSR、RAPD、RFLP、SSR這幾個分子標記技術(shù)，具有一定的局限性，且大多數(shù)是采用一種分子標記技術(shù)對金花茶遺傳多樣性的研究，對研究結(jié)果而言，具有片面性、不穩(wěn)定性;③目前采用常規(guī)的方法和分子生物學(xué)技術(shù)方法相結(jié)合對金花茶種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究仍處于空白。因此，為更全面地利用、開發(fā)和保護金花茶資源，建議在今后金花茶的遺傳多樣性研究中應(yīng)加強以上幾個方面的研究。

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