基于分子信標(biāo)及核酸染料SYBR Green Ⅰ定量檢測土壤中的汞

翟琨等

摘 要 利用分子信標(biāo)、單鏈核酸（ssDNA）及核酸染料SYBR GreenⅠ，通過同步熒光分析法，建立了一種高靈敏、高選擇性土壤汞（Hg2+）的定量檢測方法。在該體系中，分子信標(biāo)的熒光基團(tuán)設(shè)計為熒光胺（FAM），分子信標(biāo)的環(huán)設(shè)計為與ssDNA互補(bǔ)， 但有4個T堿基錯配的序列。在Hg2+存在時，分子信標(biāo)的環(huán)與ssDNA通過“THg2+T”特異性結(jié)合形成雙鏈DNA，分子信標(biāo)的莖被打開，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分開，熒光恢復(fù)； 同時，核酸染料SYBR GreenⅠ與雙鏈DNA作用，SYBR GreenⅠ的熒光信號顯著增強(qiáng)。SYBR GreenⅠ與FAM的最大激發(fā)波長與最大發(fā)射波長都很接近，通過同步熒光分析法檢測時，兩種熒光染料的熒光峰重疊，熒光信號增強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)Hg2+的高靈敏檢測。體系的最優(yōu)檢測條件為：緩沖溶液的pH=8.0，孵育溫度為50℃， 孵育4 min， 緩沖溶液中NaCl的濃度為

1 引 言

汞（Hg）是有毒的重金屬元素，在人體中具有累積效應(yīng)和神經(jīng)毒性，嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。隨著工業(yè)化、農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化及城市化進(jìn)程的加快，大量的汞通過礦物開采、施肥及空氣傳播等方式進(jìn)入農(nóng)田，而土壤中的汞又通過“土壤植物人”的途徑進(jìn)入人體，對人類健康產(chǎn)生潛在的威脅[2]。

目前，定量檢測汞的常用方法有原子發(fā)射光譜[3]、原子吸收分光光度法[4]、原子熒光[5]、色譜與光譜聯(lián)用[6，7]及電感耦合等離子體質(zhì)譜法[8]等。其中，很多方法需要較昂貴的儀器設(shè)備，不適合常規(guī)檢測。

核酸染料SYBR GreenⅠ是一種不對稱的菁類核酸染料，它本身的熒光信號很弱，與單鏈DNA幾乎不發(fā)生作用，但它與雙鏈DNA有很強(qiáng)的親和性，且與雙鏈DNA結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度會顯著增加。據(jù)報道，當(dāng)核酸染料SYBR GreenⅠ與雙鏈DNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度會增加800倍以上，是目前所發(fā)現(xiàn)的最靈敏的核酸染料之一[9]?；谔禺愋缘摹癟Hg2+T”結(jié)構(gòu)對汞的檢測方法已多有報道。Ono[10]及Wang[11]等分別基于“THg2+T”的特異性結(jié)構(gòu)建立了高靈敏、高特異性的檢測水中汞的方法。此后，各種基于“THg2+T”結(jié)構(gòu)對汞的定量檢測，進(jìn)一步提高了這類方法的靈敏度、選擇性及設(shè)備的便攜性等[12～17]。盡管基于“THg2+T”結(jié)構(gòu)對汞的定量檢測方法較多，但方法的靈敏度并不令人滿意。

本實(shí)驗(yàn)利用T堿基與Hg2+能特異性結(jié)合形成穩(wěn)定“THg2+T”結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，將分子信標(biāo)的環(huán)設(shè)計成與單鏈DNA互補(bǔ)且T堿基錯配的序列，熒光基團(tuán)設(shè)計為熒光胺（FAM）當(dāng)分子信標(biāo)在Hg2+存在時，與富含T堿基的單鏈DNA通過“THg2+T”結(jié)構(gòu)形成雙鏈，再與核酸染料SYBR GreenⅠ作用，使體系的熒光顯著增強(qiáng)。據(jù)此建立了一種高靈敏的Hg2+熒光定量檢測方法，并將其應(yīng)用于土壤樣品的分析中。

2 實(shí)驗(yàn)部分

土壤樣品為黃棕壤，取自湖北恩施白地坪汞礦附近表土（0～20 cm）。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 樣品制備 將分子信標(biāo)及單鏈核酸C分別溶解在磷酸鹽緩沖液中，均配制成2×10

Symbolm@@ 7 mol/L的溶液，各取50 μL混合均勻后，再加入50 μL不同濃度的Hg（NO3）2溶液，加緩沖液至總體積為400 μL，50℃孵育4 min，冷卻至室溫，加入100 μL SYBR GreenⅠ工作液并在室溫下反應(yīng)10 min，然后檢測體系的熒光。在所有的實(shí)驗(yàn)中，除文中標(biāo)注或說明外，分子信標(biāo)及單鏈核酸的濃度均為2×1Symbolm@@ 8 mol/L，Hg2+的濃度為4×10Symbolm@@ 8 mol/L。

土壤樣品的消化：稱取1.00 g樣品，置于消解罐中，加入6 mL王水和4 mL 30% H2O2，密封后將消解罐放入微波爐中加熱，升溫程序?yàn)?40℃保持30 min，160℃保持30 min，180℃保持25 min，樣品消解完全后自然冷至室溫。將樣品消解液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用1% HNO3定容，搖勻待測。在土壤樣品中汞的測定及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，均取50 μL的待測溶液，按樣品制備方法處理后進(jìn)行測定。

2.2.2 Hg2+的檢測

將制備好的樣品放入比色皿中，用同步熒光分析法對Hg2+進(jìn)行檢測。同步掃描的波長間隔設(shè)置為25 nm，熒光分光光度計的激發(fā)及發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為10 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法可行性分析

Hg2+的檢測原理如圖1所示。沒有Hg2+時，分子信標(biāo)的環(huán)與ssDNA中有多個TT錯配堿基，不能形成雙鏈結(jié)構(gòu)，核酸染料SYBR GreenⅠ只與分子信標(biāo)的莖（雙鏈部分）作用，由于分子信標(biāo)雙鏈很短（只有6個堿基對），其熒光信號較弱； 在有Hg2+時，分子信標(biāo)與富含T堿基的單鏈核酸通過“THg2+T”特異性結(jié)合形成雙鏈DNA，與SYBR GreenⅠ的作用增強(qiáng)，其熒光信號顯著放大； 同時，分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，熒光基團(tuán)FAM與猝滅基團(tuán)BHQ1分開，F(xiàn)AM的熒光恢復(fù)。SYBR GreenⅠ與FAM的最大激發(fā)波長與最大發(fā)射波長都很接近，它們的波長間隔（Δλ）也幾乎相等，因此，當(dāng)Hg2+通過同步熒光分析法進(jìn)行檢測時，兩種熒光染料的熒光峰重疊，熒光信號顯著增強(qiáng)，因此實(shí)現(xiàn)Hg2+的高靈敏檢測。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有分子信標(biāo)和熒光染料SYBR GreenⅠ時，體系的熒光強(qiáng)度相對較弱（圖2a）； 在此體系中引入單鏈核酸（C），而沒有Hg2+存在時，體系的熒光強(qiáng)度略有增加，但增加幅度很?。▓D2b）； 當(dāng)在上述體系中引入單鏈核酸，而又有Hg2+存在時，體系的熒光強(qiáng)度顯著增加，且Hg2+濃度不同時，其所對應(yīng)的熒光強(qiáng)度具有明顯的區(qū)別（圖2c和圖2d），證明了利用上述原理對Hg2+定量檢測的可行性。a， 分子信標(biāo)+SYBR GreenⅠ； b， a+單鏈核酸； c， b+2.5×10Symbolm@@ 8 mol/L Hg2+； d， b+5×10Symbolm@@ 8 mol/L Hg2+。a， molecular beacon （MB）+SYBR GreenⅠ； b， a+single stranded DNA （ssDNA）； c， b+2.5×10Symbolm@@ 8 mol/L Hg2+； d， b+5×10Symbolm@@ 8mol/L Hg2+

3.2 Hg2+測定條件的優(yōu)化

3.2.1 加入SYBR GreenⅠ體積的優(yōu)化 根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理，SYBR GreenⅠ在分析體系中應(yīng)該保持相對過量，但濃度過大又會產(chǎn)生大的背景信號?？疾炝藢?shí)驗(yàn)中加入SYBR GreenⅠ工作液的體積對熒光檢測信號的影響。結(jié)果表明，SYBR GreenⅠ工作液的體積在達(dá)到60 μL后，其熒光強(qiáng)度不再發(fā)生改變。為了保證實(shí)驗(yàn)過程中SYBR GreenⅠ相對過量，本實(shí)驗(yàn)選擇其體積為100 μL。

3.2.2 pH值的影響 實(shí)驗(yàn)以磷酸鹽緩沖液作為緩沖體系，考察pH值對測定結(jié)果的影響。結(jié)果表明，在pH 6.8～8.0范圍內(nèi)，體系的熒光強(qiáng)度隨pH值增加而增大，隨著pH值繼續(xù)增加，熒光強(qiáng)度略有降低。本研究選擇pH 8.0 的磷酸鹽緩沖體系。

3.2.3 孵育溫度和孵育時間的影響

加熱孵育的目的是為了打開分子信標(biāo)的莖（雙鏈部分解鏈），從而加快分子信標(biāo)與單鏈核酸反應(yīng)的速度。體系在冷卻過程中，分子信標(biāo)與富含T堿基的單鏈核酸在Hg2+存在時，通過“THg2+T”特異性結(jié)合形成雙鏈DNA。孵育時間設(shè)為4 min，考察孵育溫度進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，反應(yīng)溫度在30℃～50℃時，體系的熒光強(qiáng)度隨著溫度的升高而增大； 當(dāng)溫度超過50℃后，體系的熒光強(qiáng)度幾乎不變，說明在50℃時，分子信標(biāo)的莖可以完全被打開。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇孵育溫度為50℃。

孵育溫度設(shè)為50℃，考察了孵育時間在2～10 min內(nèi)的影響。體系的熒光強(qiáng)度隨著時間延長而增加，當(dāng)孵育時間超過4 min時，熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，分子信標(biāo)的莖已完全打開，因此孵育時間選擇為4 min。

3.2.4 離子強(qiáng)度的影響 離子強(qiáng)度對雙鏈DNA的形成具有明顯的影響。通過加入不同濃度的NaCl考察離子強(qiáng)度對體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明，NaCl濃度在10～30 mmol/L之間時，體系的熒光強(qiáng)度隨著NaCl濃度的增加而增大，當(dāng)NaCl濃度超30 mmol/L后，其熒光強(qiáng)度略有下降，這主要是因?yàn)楦邼舛菴l-對熒光染料有猝滅作用[18]。本研究選擇最適NaCl濃度為30 mmol/L。

3.3 最優(yōu)條件下的工作曲線及檢出限

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，即緩沖溶液的pH=8.0，孵育溫度為50℃， 孵育時間為4 min， 緩沖溶液中NaCl的濃度為30 mmol/L，SYBR Green I工作液的體積為100SymbolmA@ L，測定不同濃度Hg2+存在時的體系熒光強(qiáng)度（圖3）。Hg2+濃度在5×10Symbolm@@ 10～4×10

3.4 干擾實(shí)驗(yàn)

對土壤中常見的干擾離子Ca干擾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖4所示，加入土壤中的干擾離子濃度為Hg2+濃度（4×10

Symbolm@@ 8 mol/L）1000倍時，Hg2+所對應(yīng)的相對熒光強(qiáng)度仍遠(yuǎn)大于其它干擾離子，表明本方法法對土壤中Hg2+的檢測具有很高的選擇性。

3.5 土壤中汞含量的檢測及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

分別取4份相同的土壤樣品，分別加入不同濃度Hg（NO3）2，按前述方法消化后，采用本法檢測各樣品中汞的含量（表1）。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)所測土壤樣品中汞的含量為3.10 mg/kg，加標(biāo)樣品的回收率為97.7%～100.6%。

取2份相同的土壤樣品，按前述方法消化后，分別用本方法和原子熒光法測定汞含量，結(jié)果分別為3.11和3.23 mg/kg（n=3）， 兩種方法測定結(jié)果基本相同，說明本方法具有較好的準(zhǔn)確性。

3.5 土壤中汞含量的檢測及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

分別取4份相同的土壤樣品，分別加入不同濃度Hg（NO3）2，按前述方法消化后，采用本法檢測各樣品中汞的含量（表1）。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)所測土壤樣品中汞的含量為3.10 mg/kg，加標(biāo)樣品的回收率為97.7%～100.6%。

取2份相同的土壤樣品，按前述方法消化后，分別用本方法和原子熒光法測定汞含量，結(jié)果分別為3.11和3.23 mg/kg（n=3）， 兩種方法測定結(jié)果基本相同，說明本方法具有較好的準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用分子信標(biāo)及含TT錯配的堿基的單鏈核酸，結(jié)合核酸染料SYBR GreenⅠ，建立了一種土壤中Hg2+的定量檢測方法。與以前報道的基于“THg2+T”結(jié)構(gòu)測定汞的分析方法相比[10，16，17]，本方法利用核酸染料SYBR GreenⅠ及分子信標(biāo)的熒光基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光采用同步熒光法對汞進(jìn)行檢測，方法的靈敏度更高，檢出限更低，而分子信標(biāo)的引入，使方法的特異性增強(qiáng)，選擇性更高。

References

1 Ekinci M， Ceylan E， Keles S， Cagatay H H， Apil A， Tanyildiz B， Uludag G. Med. Sci. Monitor， 2014， 20： 1284-1290

2 Leterme B， Blanc P， Jacques D. Environ. Sci. Pollut. R.， 2014， 21（21）： 12279-12293

3 Han F X X， Patterson W D， Xia Y J， Sridhar B B， Su Y. Water Air Soil Poll.， 2006， 170（1）： 161-171

4 HUANG ZhenNong， SUN Yi， RUAN XiaoLin， WU BangHua， ZHANG AiHua， HUANG JunYi， HUANG YanLing， HUANG HanLin. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2014， 34（5）： 1412-1415

黃振儂， 孫 毅， 阮小林， 吳邦華， 張愛華， 黃鈞宜， 黃燕玲， 黃漢林. 光譜學(xué)與光譜分析， 2014， 34（5）： 1412-1415

5 WANG Mei， LI Shan， ZHOU JianDong， XU Ying， LONG JunBiao， YANG BingYi. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2014， 34（8）： 2254-2258

王 梅， 李 姍， 周建棟， 徐 英， 龍軍標(biāo)， 楊冰儀. 光譜學(xué)與光譜分析， 2014， 34（8）： 2254-2258

6 Yin Y G， Liu Y， Liu J F， He B， Jiang G B. Anal. Methods， 2012， 4（4）： 1122-1125

7 GU YuXiao， MENG Mei， SHAO JunJuan， SHI JianBo， HE Bin， JIANG GuiBin. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（11）： 1754-1757

顧昱曉， 孟 梅， 邵俊娟， 史建波， 何 濱， 江桂斌. 分析化學(xué)， 2013， 41（11）： 1754-1757

8 Chen X P， Han C， Cheng H Y， Wang Y C， Liu J H， Xu Z G， Hu L. J. Chromatogr. A， 2013， 1314： 86-93

9 Xiang D S， Zhai K， Xiang W J， Wang L Z. Talanta， 2014， 129： 249-253

10 Ono A， Togashi H. Angew. Chem. Int. Edit.， 2004， 43（33）： 4300-4302

11 Wang J， Liu B. Chem. Commun.， 2008， 39： 4759-4761

12 Ge J， Li X P， Jiang J H， Yu R Q. Talanta， 2014， 122： 85-90

13 Ma F， Zhang Y， Qi H， Gao Q， Zhang C， Miao W. Biosens. Bioelectron.， 2012， 32（1）： 37-42

14 Stobiecka M， Molinero A A， Chalupa A， Hepel M. Anal. Chem.， 2012， 84（11）： 4970-4978

15 Zhang Y， Zhao H， Wu Z， Xue Y， Zhang X， He Y， Li X， Yuan Z. Biosens. Bioelectron.， 2013， 48： 180-187

16 LEI ZhaoJing， ZHANG CunZheng， HU QiuHui， LIU Yuan， ZHANG Qiang， LIU XianJin. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（12）： 1827-1831

雷兆靜， 張存政， 胡秋輝， 劉 媛， 張 強(qiáng)， 劉賢金. 分析化學(xué)， 2012， 40（12）： 1827-1831

17 BO HongYan， HUANG ShaoFeng， ZENG WenJin， ZHANG Mi， DU QingLan， GUO QingYu， GAO Qiang. Chinese J. Anal. Chem.， 2011， 39（12）： 1893-1897

薄紅艷， 黃紹峰， 曾文靜， 張 宓， 杜青蘭， 郭慶羽， 高 強(qiáng). 分析化學(xué)， 2011， 39（12）： 1893-1897

18 Gao XiangYang. Instrumental Analysis. Beijing： Science Press， 2009： 56

高向陽. 新編儀器分析（第三版）. 北京： 科學(xué)出版社， 2009： 56

Abstract A highly sensitive and selective fluorescence method for quantitative detection of mercury in soil was developed based on molecular beacon （MB）， singlestranded nucleic acid （ssDNA） and nucleic acid dye SYBR Green I by synchronous fluorescence analysis. In this strategy， the fluorophore of MB was 6carboxyfluorescein group （FAM）， and the loop of MB was complementary to the ssDNA with four TT mismatches. In the presence of Hg2+， the MBs and ssDNA with TT mismatches formed doublestranded DNA （dsDNA） via THg2+T coordination structure， then the fluorophore FAM was separated from the quencher BHQ1， thus emitted fluorescence. Meanwhile， SYBR Green I bound to dsDNA， so the fluorescence intensity of SYBR Green I was significantly enhanced. When subjected to synchronous fluorescence analysis， the fluorescence peaks of FAM and SYBR Green I overlapped completely， so the fluorescence signal of system could be significantly enhanced. Thus， highly sensitive fluorescence quantitative detection for Hg2+could be realized. In this strategy， the optimal conditions for Hg2+ determination were as follows： buffer solution pH of 8.0， incubation temperature of 50℃， incubation time of 4 min， 30 mmol/L NaCl in buffer solution and the volume of SYBR Green I of 100 μL. Under the optimum conditions， the total fluorescence intensity of SYBR GreenⅠ and FAM exhibited a good linear dependence on quantity of Hg2+ in the range of 5.0×10

Symbolm@@ 10-400×10

Symbolm@@ 8 mol/L. The regression equation was ΔI=1.3949C+19.3596 with a correlation coefficient of 0.9976 （R2）， where ΔI was the total fluorescence intensity difference in the presence and absence of Hg2+. The detection limit was 3×10

Symbolm@@ 10 mol/L （3σ， n=11）. The proposed method exhibited good precision， high selection， simple operation， fast detection speed， low detection limit and high sensitivity. This method was applied to detect mercury ion in soil and a satisfactory recovery of 97.7%-100.6% was obtained. The detection result was consistent with that by atomic fluorescence spectrometric method.