菜豆植物凝集素活性的測(cè)定方法研究

李佳楠等

摘要：探索分光光度法測(cè)定菜豆（Phaseolus vulgaris）植物凝集素活性的最佳測(cè)定條件，分析了56個(gè)菜豆品種的植物凝集素活性。結(jié)果表明，紅細(xì)胞懸液濃度2×108個(gè)/mL，凝血10 min后測(cè)定OD416 nm，為菜豆植物凝集素的最佳測(cè)定條件。在該條件下，分析了56個(gè)菜豆品種中的植物凝集素活性濃度，旨在為分析菜豆植物凝集素的毒效提供參考。

關(guān)鍵詞：菜豆（Phaseolus vulgaris）；植物凝集素；分光光度法；活性

中圖分類(lèi)號(hào)：S532 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）12-3005-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.053

Determination of the Activity of Lectin in Kidney Bean

LI Jia-nan，YANG Wei，YUAN Sha，CHEN Chan-you

（Department of Biotechnology， Life Science College， Jianghan University， Wuhan 430056， China）

Abstract： The optimal detecting lectin activity in Phaseolus vulgaris by spectrophotometry and 56 varieties were analyzed in this paper. The results showed that the suitable concentration of red blood cell was 2×108 cell/mL， and the best coagulation time was 10 min and detected at 416 nm. The lectin activity concentration of 56 varieties were determined under to the established conditions to provide a reference for the toxic effects analysis of lectin in Phaseolus vulgaris.

Key words： Phaseolus vulgaris； lectin； spectrophotometry； activity

菜豆（Phaseolus vulgaris）為豆科一年生草本植物，別名四季豆、蕓豆、豆角，是常見(jiàn)食用蔬菜[1]，但其中的植物凝集素（PHA），胰蛋白酶抑制劑，皂甙和植酸等對(duì)人體均有一定的毒性作用，常常導(dǎo)致菜豆中毒事件[2-5]。植物凝集素是植物界中廣泛存在的一類(lèi)能夠可逆結(jié)合到特異單糖或多糖上的蛋白質(zhì)，其相對(duì)分子量為126～136 kDa，含有4個(gè)亞基，每個(gè)亞基都有1個(gè)與糖結(jié)合位點(diǎn)，能使紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集現(xiàn)象[6，7]。迄今為止，在已發(fā)現(xiàn)的1 000多種菜豆植物凝集素中，豆科植物凝集素有600多種[8]。

紅細(xì)胞凝集法是目前應(yīng)用最為廣泛的植物凝集素檢測(cè)方法[9]。該方法利用兔、羊、人等動(dòng)物紅細(xì)胞，配制成一定濃度的紅細(xì)胞懸液，將凝集素溶液經(jīng)過(guò)倍比稀釋后加入等體積紅細(xì)胞懸液，靜置一段時(shí)間后，通過(guò)肉眼觀察或比色測(cè)定活性[10-12]。但目前已報(bào)道的凝集素測(cè)定方法多為定性或半定量方法，難以定量分析凝集素濃度與血細(xì)胞凝集效應(yīng)之間的關(guān)系。本試驗(yàn)采用分光光度法優(yōu)化了菜豆植物凝集素標(biāo)準(zhǔn)品的活性測(cè)定條件，并測(cè)定了56個(gè)菜豆品種的植物凝集素活性濃度，為驗(yàn)證菜豆植物凝集素的毒效關(guān)系提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菜豆鮮莢由江漢大學(xué)湖北省豆類(lèi)（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)基地提供。供試樣品均為2012～2013年春季栽植，選取菜豆開(kāi)花后15 d成熟莢作為研究對(duì)象，共計(jì)56個(gè)品種；菜豆植物凝集素標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%，Sigma）；Alsevers（Biosera）；兔紅細(xì)胞懸液自制；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 菜豆豆莢浸提液的制備 將新鮮菜豆豆莢打碎成漿后，稱取10 g，加入PBS溶液定容至10 mL，4 ℃搖床振蕩浸提24 h，8 000 r/min離心10 min，取上清液作為待測(cè)樣液，每樣分別提取3次。

1.2.2 兔紅細(xì)胞最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定 取兔靜脈血，配制成2×108個(gè)/mL的紅細(xì)胞懸液，取100 μL加入酶標(biāo)板，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（200～1 000 nm）測(cè)定血細(xì)胞的吸光值。

1.2.3 不同紅細(xì)胞濃度下的凝血反應(yīng) 在酶標(biāo)板中每孔加入100 μL的1 mg/mL菜豆植物凝集素標(biāo)準(zhǔn)品，以二倍稀釋法設(shè)置7個(gè)濃度梯度，濃度在1～0.015 625 mg/mL之間，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行。將兔紅細(xì)胞配制成濃度為2×108、1×108、5×107個(gè)/mL的紅細(xì)胞懸液，每孔加入20 μL紅細(xì)胞懸液，且每個(gè)紅細(xì)胞濃度設(shè)置3個(gè)平行?；旌暇鶆?，靜置10 min，測(cè)定OD416 nm，繪制菜豆植物凝集素凝血活性濃度曲線。

1.2.4 不同凝集時(shí)間下的凝血反應(yīng) 將兔紅細(xì)胞配制成2×108個(gè)/mL的紅細(xì)胞懸液，于酶標(biāo)板中每孔加入100 μL的上述梯度濃度的菜豆植物凝集素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每濃度設(shè)置3個(gè)平行。每孔加入20 μL的2×108個(gè)/mL紅細(xì)胞懸液?；旌暇鶆?，靜置觀察，分別于5、10、20 min測(cè)定OD416 nm，繪制菜豆植物凝集素凝血活性濃度準(zhǔn)曲線。

1.2.5 菜豆植物凝集素活性濃度測(cè)定 酶標(biāo)板每孔加入100 μL菜豆豆莢浸提液和100 μL PBS緩沖液，充分混勻，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。每孔加入20 μL的2×108個(gè)/mL紅細(xì)胞懸液，室溫靜置10 min，測(cè)定OD416 nm，通過(guò)上述曲線方程計(jì)算菜豆植物凝集素濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜豆凝集素測(cè)定的最佳條件

兔紅細(xì)胞的光譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，當(dāng)吸收波長(zhǎng)為416 nm時(shí)，濃度為2×108個(gè)/mL的兔紅細(xì)胞懸液具有較大吸光值，因此選擇416 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

將濃度分別為2×108、1×108、5×107個(gè)/mL的紅細(xì)胞懸液滴加到7個(gè)濃度梯度的菜豆植物凝集素標(biāo)準(zhǔn)品溶液中，凝集時(shí)間10 min，測(cè)定OD416 nm，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示3個(gè)濃度的紅細(xì)胞均有明顯凝血效應(yīng)，其中濃度為2×108個(gè)/mL紅細(xì)胞的凝血反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較好（圖2），故選擇2×108個(gè)/mL作為紅細(xì)胞的工作濃度。

在紅細(xì)胞濃度為2×108個(gè)/mL時(shí)，分別測(cè)定放置5、10、20 min時(shí)，7個(gè)菜豆植物凝集素標(biāo)準(zhǔn)品的凝血效應(yīng)。以O(shè)D416 nm做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示凝血時(shí)間為10 min時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性最好（圖3），故選擇10 min作為反應(yīng)時(shí)間。

2.2 菜豆品種植物凝集素凝集活性濃度

根據(jù)菜豆植物凝集素測(cè)定的最佳條件和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-0.658 0x+1.442 7，測(cè)定56個(gè)菜豆品種豆莢中的植物凝集素凝集活性，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，菜豆凝集素總體活性濃度水平差異較大?；钚詽舛茸罡呤?0號(hào)（10.85 mg/g），最低是45號(hào)（0.025 mg/g），56個(gè)菜豆品種可以分為2個(gè)品種群：①高活性濃度品種群（4.36～10.85 mg/g），共5個(gè)品種，即40號(hào)、38號(hào)、33號(hào)、44號(hào)和6號(hào)；②低活性濃度品種群（0～2 mg/g），其余51個(gè)品種。而在2～4.36 mg/g之間沒(méi)有品種分布。

3 討論

目前凝集素活性的測(cè)定方法主要分為兩大類(lèi)：一類(lèi)以觀察血細(xì)胞凝集效果的定性分析，如V形酶標(biāo)板法、平板法、試管法等[10-12]；另一類(lèi)是以分光光度計(jì)及酶標(biāo)儀測(cè)定的特定波長(zhǎng)吸光度的半定量分析方法[13]。這些方法通常存在以下不足：①只能定性或半定量測(cè)定；②配制標(biāo)準(zhǔn)紅細(xì)胞懸液多用體積百分?jǐn)?shù)來(lái)表示，不能定量分析結(jié)果，且批次間結(jié)果差異大；③確定讀取終點(diǎn)時(shí)間的隨意性較大，肉眼觀察結(jié)果的主觀性大，精確度低；④測(cè)定方法多種多樣，測(cè)得的結(jié)果千差萬(wàn)別，難以重復(fù)。

本試驗(yàn)優(yōu)化了分光光度法測(cè)定菜豆植物凝集素的條件，測(cè)定了不同菜豆的植物凝集素活性。在植物凝集素測(cè)定中，通過(guò)制備已知數(shù)量的紅細(xì)胞懸液，降低各批次間測(cè)定的不確定性，同時(shí)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線將樣品菜豆的凝集素活性換算為濃度，實(shí)現(xiàn)菜豆中植物凝集素活性濃度的定量分析。該方法較傳統(tǒng)測(cè)定方法更客觀，適用于大量樣本同時(shí)快速檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果為分析不同來(lái)源及品種菜豆植物凝集素的毒效關(guān)系提供了參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李笑梅.菜豆植物凝集素提取方法的研究[J].食品科學(xué)，2008， 29（10）：267-269.

[2] 張曉艷，王 坤，王述民.普通菜豆種質(zhì)資源遺傳多樣性研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2007，8（3）：359-365.

[3] TEIXEIRA-SA D M，REICHER F，BRAGA R C，et al.Isolation of a lectin and a galactoxyloglucan from Mucuna sloanei seeds [J].Phaytochemistry，2009，70（17-18）：1965-1972.

[4] 王昌梅，張麗芬，楊明潔，等.大白蕓豆植物凝集素毒性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（28）：13639-13640.

[5] LAM S K，NG T B.Isolation and characterization of French bean hemagglutinin with antitumor， antifungal， and anti-HIV-1 reverse transcriptase activities and an exceptionally high yield[J]. Phytomedicine， 2010，17（6）： 457-462.

[6] 李笑梅.菜豆凝集素的分離及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定[J].食品科學(xué)，2008，29（11）：328-331.

[7] 殷曉麗，李婷婷，劉東亮等.豆科凝集素研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志，2011，31（7）：133-139.

[8] 張紅葉，殷頌華.急性菜豆中毒114例臨床分析[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)信息，2004，20（5）：45-47.

[9] 陳婧宜.刀豆凝集素提取分離純化及性質(zhì)研究[D].江蘇無(wú)錫：江南大學(xué)，2008.

[10] 李笑梅，王 松.菜豆皂苷抗氧化及抑菌活性研究[J].食品科學(xué)，2011，32（17）：81-84.

[11] 楊華東，袁偉華，歐陽(yáng)雪君.蓖麻凝集素研究進(jìn)展[J].亞熱帶植物科學(xué)，2009，38（3）：90-94.

[12] 何 濤，張 濤，吳昌英，等.小白蕓豆凝集素的分離純化及性質(zhì)研究[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，3（2）：107-110.

[13] 王洪新，婁在祥.菜用豆毒素及中毒機(jī)理研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（25）：7733-7735.