維生素K1凍干標準物質(zhì)的研制

張曉光， 黃 挺， 張 偉， 黃 亮， 全 燦， 李紅梅， 楊 屹

（1.北京化工大學理學院，北京100029； 2.中國計量科學研究院，北京100029；3.廣州計量檢測技術研究院，廣東廣州510030）

維生素K1凍干標準物質(zhì)的研制

張曉光1， 黃 挺2， 張 偉2， 黃 亮3， 全 燦2， 李紅梅2， 楊 屹1

（1.北京化工大學理學院，北京100029； 2.中國計量科學研究院，北京100029；3.廣州計量檢測技術研究院，廣東廣州510030）

采用二甲基亞砜（DMSO）作為凍干標準物質(zhì)的溶劑，以重量法準確配制維生素K1／DMSO溶液，再進行分裝、冷凍干燥，經(jīng)定性分析、定值分析、均勻性檢驗、穩(wěn)定性考察和不確定度評定，研制了維生素K1凍干標準物質(zhì)。以維生素K1純度標準物質(zhì)溶液為校準品，對得到的凍干物質(zhì)進行了高效液相色譜法定值分析，凍干標準物質(zhì)的準確定值結果為0.96mg／mL，相對擴展不確定度為7%。建立的維生素K1凍干標準物質(zhì)研制方法，對于臨床檢驗中維生素K1的準確測定和相關疾病的正確診斷治療以及維生素K1長期保存具有重要意義。

計量學；維生素K1；標準物質(zhì)；冷凍干燥；二甲基亞砜；高效液相色譜法

1 引 言

維生素K1（phylloquinone）促進骨的重建和鈣的動員，是維持人體生理功能的重要營養(yǎng)素［1］。準確測定血清維生素K1對相關疾病的正確診斷以及治療具有重要意義。研制帶有準確純度及不確定度水平的標準物質(zhì)，可為臨床檢驗、醫(yī)學、營養(yǎng)學、衛(wèi)生檢驗檢疫等方面的測量和研究工作提供技術支持和量值溯源保障［2～4］。維生素K1的溶劑穩(wěn)定性較差，干燥后的樣品可以長期保存。凍干技術是基于凍結制品的升華來達到脫水的目的，由于干燥過程中沒有液體，液體以固體狀態(tài)直接升華，且在低溫、低氧下進行，大多數(shù)生物反應停滯，使物料的原有結構和形狀受到最小程度的破壞，從而得到具有優(yōu)良品質(zhì)的產(chǎn)品［5］。同時，二甲基亞砜（DMSO）是一種良好的有機溶劑，在18℃以下就能變成固態(tài)。利用DMSO作為溶劑溶解樣品，凍干。不需要超低溫預冷樣品，提高了冷凍干燥的效率。本課題組根據(jù)國際標準化組織ISO導則35［6］，研制了維生素K1凍干標準物質(zhì)。首先采用重量法溶解維生素K1，再分裝，凍干，得到維生素K1凍干物質(zhì)，以維生素K1純度標準物質(zhì)為參照，利用高效液相色譜法，對維生素K1凍干標準物質(zhì)進行了定值分析。標準物質(zhì)用戶只需按規(guī)定在凍干標準物質(zhì)中加入一定體積的溶劑，即可作為溶液標準物質(zhì)使用。

2 實驗部分

2.1 主要儀器與試劑

美國Agilent 1200型高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器（DAD）；Agilent6410型三重四級桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；冷凍干燥機（Christ ALPHA 1-2 LD plus，德國）；布魯克公司Bruker Ascend 800核磁共振儀（帶有5 mm CPQCI超低溫探頭）；Inertsil ODS-SP，250 mm×4.6 mm×5μm液相色譜柱（GL Science Inc.日本）。

維生素K1純度標準物質(zhì)由本課題組研制（中國計量科學研究院化學計量與分析科學研究所，99.2%，相對擴展不確定度0.6%（k=2））；氘代二氯甲烷（CD2Cl2）（Sigma-Aldrich公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；二甲基亞砜（DMSO）（色譜純，美國Fisher Scientific公司）；其余試劑為分析純；實驗用水皆為超純水。

2.2 定性分析

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和核磁共振法對維生素K1凍干標準物質(zhì)主成分進行定性分析。

2.3 維生素K1凍干物質(zhì)制備與定值

2.3.1 維生素K1凍干物質(zhì)的制備

利用重量法準確配制1 mg／mL的維生素K1的純度標準物質(zhì)的DMSO溶液共100 mL，分裝至100個2 mL的棕色玻璃瓶，每瓶1 mL，然后置于-20℃冰箱30 min，觀察瓶內(nèi)溶液完全凝固，立刻取出，置于冷凍干燥儀內(nèi)，進行冷凍干燥4 h，觀察瓶內(nèi)樣品被完全干燥后，取出樣品，置于-20℃，避光，密封保存。

2.3.2 維生素K1凍干物質(zhì)定值

凍干樣品使用前放到室溫平衡，并用1 mL DMSO復溶。同時用重量法準確配制1mg／mL的維

式中：cd為維生素K1凍干物質(zhì)配制濃度，mg／mL；cr為維生素K1純度標準物質(zhì)配制濃度，mg／mL；Ar為維生素K1純度標準物質(zhì)液相峰面積；Ad為維生素K1凍干物質(zhì)液相峰面積。

2.4 均勻性檢驗

根據(jù)ISO Guide 35（2006）的要求，對上述標準物質(zhì)進行了均勻性檢驗。具體抽樣檢驗方法為從每種標準物質(zhì)中隨機抽取15個包裝，進行瓶間均勻性檢驗；每一瓶取3個子樣，進行瓶內(nèi)均勻性檢驗。檢驗方法為定值方法，使用測量數(shù)據(jù)計算均勻性引入的不確定度ubb。

2.5 穩(wěn)定性考察

根據(jù)ISO Guide 35（2006），標準物質(zhì)穩(wěn)定性考察按先密后疏的原則，在一定時間間隔內(nèi)選擇定值方法，檢測在規(guī)定條件下保存的標準物質(zhì)復溶濃度隨時間的變化情況，使用測量數(shù)據(jù)計算長期和短期穩(wěn)定性引入的不確定度ults和usts。

長期穩(wěn)定性：將維生素K1樣品置于低溫（4℃）儲存條件，凍干樣品置于-20℃儲存條件下，分別在第1、3、6個月進行穩(wěn)定性監(jiān)測。每次取5個包裝，每個包裝取一個子樣，測3次，計算平均值，把5個包裝測量結果平均值作為檢測結果。

短期穩(wěn)定性：將維生素K1樣品以及凍干樣品置于50℃條件下，分別在第1、3、5、7天進行穩(wěn)定性監(jiān)測。具體檢測方法與長期穩(wěn)定性檢測相同。

2.6 凍干標準物質(zhì)不確定度分析

2.6.1 以純度標準物質(zhì)為標準用LC檢測DMSO復溶后凍干物質(zhì)濃度的不確定度

主要由維生素K1純品標準物質(zhì)的不確定度up和用LC多次檢測得到凍干物質(zhì)濃度的相對不確定度uLC引入。生素K1純度標準物質(zhì)甲醇溶液作為標準，利用高效液相色譜法分別測定凍干樣品和標準樣品的峰面積。高效液相色譜法條件：流動相為甲醇∶水（92∶8）等度洗脫；流速：1 mL／min；進樣量：5μL；樣品為1 mg／mL維生素K1甲醇溶液；檢測波長：274 nm。根據(jù)式（1）可算出凍干樣品的濃度大小

2.6.2 均勻性與穩(wěn)定性相對不確定度

均勻性與穩(wěn)定性相對不確定度計算方法參見ISO Guide 35（2006）要求。

2.6.3 凍干標準物質(zhì)的不確定度

2.6.4 相對擴展不確定度（包含因子k=2）

3 結果與討論

3.1 維生素K1定性分析

圖1為維生素K1的質(zhì)譜圖，可以看出，質(zhì)荷比m／z為451.5和187.10與文獻［7，8］一致，可以初步對維生素K1定性。核磁共振結果見圖2，圖中橫軸表示化學位移，縱軸表示共振強度。與維生素K1標準譜圖相一致［9］，可以確認樣品原料為維生素K1。

圖1 維生素K1的質(zhì)譜圖

圖2 維生素K1核磁共振譜圖

3.2 維生素K1凍干物質(zhì)的制備

制備維生素K1凍干物質(zhì)過程中要考慮到以下幾方面：（1）樣品的穩(wěn)定。因為樣品不同，其穩(wěn)定存在狀態(tài)不同，維生素K1由于在溶液狀態(tài)下的不穩(wěn)定性，不能長期保存，這樣給用戶帶來了困擾，而其干燥后的樣品能長期保存。（2）干燥采用的方法。干燥樣品的方法很多，而經(jīng)冷凍干燥技術干燥后的樣品結構和形狀僅受到最小程度的破壞，從而得到具有優(yōu)良品質(zhì)的產(chǎn)品。（3）溶劑選擇。能溶解維生素K1的溶劑很多（甲醇、乙醇等），但這些溶劑溶解的樣品在凍干之前均需要在超低溫下預冷，而DMSO作為一種良好的有機溶劑在18℃就能完全成為固態(tài)，從而直接可以進行凍干，減少了冷凍干燥的時間。

3.3 維生素K1定值分析

3.3.1 以高效液相色譜法（HPLC）對維生素K1定值

圖3為維生素K1用DMSO復溶后的高效液相色譜圖。以維生素K1純度標準物質(zhì)為標準，利用外標法測定復溶后的維生素K1凍干物質(zhì)。利用測得標準品和樣品的峰面積根據(jù)式（1）可得到凍干物質(zhì)濃度大小。

圖3 維生素K1的液相色譜定值譜圖（檢測波長274 nm）

4 定值結果以及不確定度評定

4.1 維生素K1凍干物質(zhì)的定值結果

以維生素K1純度標準物質(zhì)配制的溶液為標準（1 mg／mL），根據(jù)式（1）定值凍干物質(zhì)。結果見表1。

表1 LC定值結果 mg·mL-1

4.2 維生素K1凍干物質(zhì)的均勻性檢驗

凍干物質(zhì)均勻性檢驗結果及其不確定度ubb的計算見表2。

4.3 維生素K1凍干物質(zhì)的穩(wěn)定性考察

長期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性結果以及不確定度見表3和4。

表2 均勻性檢驗結果 mg·mL-1

表3 長期穩(wěn)定性檢驗結果 mg·mL-1

表4 短期穩(wěn)定性檢驗結果 mg·mL-1

4.4 維生素K1凍干標準物質(zhì)不確定度評定

4.4.1 LC檢測復溶后凍干物質(zhì)濃度的不確定度

主要由維生素K1純品標準物質(zhì)的不確定度up和用LC多次檢測得到凍干物質(zhì)的濃度的相對不確定度uLC引入，根據(jù)式（2），

4.4.2 維生素K1凍干標準物質(zhì)的不確定度

主要由定值不確定度、樣品均勻性不確定度、長期穩(wěn)定性不確定度、短期穩(wěn)定性不確定度引入，根據(jù)式（3）、式（4）：

相對擴展不確定度

維生素 K1凍干標準物質(zhì)定值結果為0.96mg／mL，相對擴展不確定度為7%（k=2）。

5 結 論

本文以DMSO為溶劑，利用冷凍干燥技術制備了維生素K1凍干標準物質(zhì)，同時用其純度標準物質(zhì)為標準，采用HPLC方法對凍干標準物質(zhì)進行了定值分析，使得到的結果準確可靠。此外，還對維生素K1凍干標準物質(zhì)進行了均勻性檢驗、穩(wěn)定性考察、不確定度評定，確保了用戶在不同時間、使用不同包裝的該種標準物質(zhì)時，所使用的量值及不確定度都是準確可靠的，制備得到樣品能長期保存，用戶使用時只需加入一定的DMSO復溶即可使用。對于維生素K1保存和準確測定具有重要意義。

］

［1］ 李向榮，方曉，陳青俊，等.反相液相色譜法同時測定食物中維生素K1和K2［J］.營養(yǎng)學報，1988，20（1）：72-75.

［2］ 李云巧，王東冬.稀土溶液標準物質(zhì)的研制［J］.計量學報，2003，24（4）：348-351.

［3］ 馬聯(lián)弟，王晶，曹文祺，等.糧食中營養(yǎng)成分標準物質(zhì)制備技術［J］.計量學報，2004，25（3）：275-277.

［4］ 楊夢瑞，戴新華，楊屹，等.冰凍人血清尿酸標準物質(zhì)的研制［J］.計量學報，2010，31（1）：86-90.

［5］ Boss E A，F(xiàn)ilho R M，Coseelli E.Freeze drying process：real time model and optimization［J］.Chemical Engineering and Processing，2004，43（12）：1475-1485.

［6］ ISO Guide 35：2006.Reference materials-General and statistical principles for certification［S］.

［7］ Véronique D，Mickael P，F(xiàn)rancois L，et al.Quantitative determination of plasma vitamin K1by high-performance liquid chromatography coupled to isotope dilution tandem mass spectrometry［J］.Journal of analytical biochemistry，2010，401（1）：7-14.

［8］ Qin X S，Ai DW，Li D，et al.HPLC-APCI-MS for the determination of vitamin K1in human plasma：Method and clinical application［J］.Journal of Chromatography B，2008，875（2）：541-545.

［9］ National Institute of Advanced Industrial Science and Technology（AIST），Japan，Spectral Database for Organic Compounds［DB］.http：／／sdbs.db.aist.go.jp／sdbs／cgi-bin／direct_frame_top.cgi，2014-03-14.

Development of a Certified Reference Material for Lyophilized Vitam in K1

ZHANG Xiao-guang1， HUANG Ting2， ZHANGWei2， HUANG Liang3，QUAN Can2， LIHong-mei2， YANG Yi1
（1.College of Science，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China；2.National Institute of Metrology，Beijing 100029，China；3.Guangzhou Institute of Measuring and Testing Technology，Guangzhou，Guangdong 510030，China）

Dimethyl sulfone（DMSO）is firstly applied as the solvent for a lyophilized certified reference material（CRM）.Vitamin K1／DMSO solution is prepared by gravimetry，and is sub-divided and lyophilized，the lyophilized vitamin K1CRM is developed through qualitative analysis，quantitative analysis，homogeneity study，stability study and uncertainty evaluation.Certified value of lyophilization vitamin K1is analyzed by high performance liquid chromatography method，using the vitamin K1purity CRM as a calibrant.The certified value is0.96 mg／mL，with the relative expanded uncertainty of7%.Themethod of CRM lyophilized vitamin K1makes great significance for the accurate determination the disease in clinical examination and the long-term preservation of vitamin K1.

Metrology；Vitamin K1；Certified referencematerial；Lyophilized；Dimethyl sulfone；High performance liquid chromatography

TB99

：A

：1000-1158（2015）03-0333-04

10.3969／j.issn.1000-1158.2015.03.23

2014-03-14；

：2015-02-16

國家科技支撐計劃課題（2013BAK10B01）

張曉光（1988-），男，云南大理人，北京化工大學碩士生，主要從事分析化學方面的研究。zxg_4545＠126.com