金銀花中綠原酸的超聲波提取工藝優(yōu)化

黃小梅，鄧祥，吳狄

（1.四川文理學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系，四川達(dá)州635000；2.四川文理學(xué)院"特色植物開發(fā)研究"四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川達(dá)州635000）

金銀花中綠原酸的超聲波提取工藝優(yōu)化

黃小梅1，2，鄧祥1，2，吳狄1，2

（1.四川文理學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程系，四川達(dá)州635000；2.四川文理學(xué)院"特色植物開發(fā)研究"四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川達(dá)州635000）

研究從金銀花中提取綠原酸的工藝。通過研究乙醇濃度、溫度、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率等因素對提取效率的影響。在運(yùn)用超聲波法下得出綠原酸提取工藝的最佳工藝參數(shù)：乙醇濃度為70%，浸提溫度為55℃，料液比為1∶20（g/mL），超聲時(shí)間為1.5 h，超聲功率為700 W。在此條件下采用紫外分光光度法（UV）對綠原酸產(chǎn)品進(jìn)行檢測，在328 nm波長下，得到綠原酸的最大峰值，計(jì)算得率為7.887%。

金銀花；綠原酸；提取工藝；正交試驗(yàn)；超聲法

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花[1]，具有很高的藥用價(jià)值，為常用抗菌消炎和清熱解毒中藥材[2]。其化學(xué)成分為綠原酸（chlorogenic acid，簡稱CHA）、異綠原酸、揮發(fā)油、咖啡酸、黃酮類化合物、三萜皂苷和木犀草素等。其中綠原酸是金銀花的主要藥效活性成分之一[3]，其含量高低是評價(jià)金銀花質(zhì)量的重要依據(jù)。

綠原酸具有抗菌、抗病毒、增高白血球、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用。因而可作為食品中的添加劑、植物生長激素及一些高級化妝品的添加劑等。綠原酸是食品、藥品、化妝品等工業(yè)的重要原料[4-5]。因此，開發(fā)綠原酸市場前景廣闊、發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

金銀花原產(chǎn)我國，分布各省?，F(xiàn)代生藥學(xué)研究資料表明，藥用植物種類的變異和生長環(huán)境因子是影響生藥品質(zhì)的重要因素，中藥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是其所含有的化學(xué)成分[6]，為探討川產(chǎn)道地金銀花的品質(zhì)，全面評價(jià)其藥材質(zhì)量。本文以川產(chǎn)道地金銀花為原料，采用UV法對金銀花中CHA的含量進(jìn)行測定，以乙醇為提取溶劑，研究了金銀花中綠原酸的超聲波提取工藝，確定出最佳提取條件，以期為金銀花中綠原酸的提取提供參考。

1 儀器、試劑與樣品

1.1 儀器

UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)：日本島津；FA1104N型電子天平：上海菁海；FW-135型中草藥粉碎機(jī)：上海超億；TG20-WS型離心機(jī)：鄭州宏朗；HN-1000D型超聲波萃取儀：上海汗諾；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特；60目的篩子。

1.2 試劑與樣品

金銀花：四川達(dá)縣金佛中藥材種植有限公司；綠原酸對照品：阿拉丁；無水乙醇為分析純：成都科龍；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2 方法與實(shí)驗(yàn)

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 對照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品5.0 mg，用適量70%乙醇充分溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，搖勻做對照品儲備試液。此試液中綠原酸的濃度為100 μg/mL。

2.1.2 測定波長的選擇

將對照品綠原酸溶液和供試品溶液在200 nm～400 nm進(jìn)行掃描，其均在328 nm波長處有最大吸收，故檢測波長選為328 nm。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精確移取綠原酸對照品溶液0、1、2、4、6、8、10 mL于7個(gè)25 mL容量瓶中，然后用70%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置。以第1管作空白對照，在最大吸收波長328 nm處測定吸光度，以綠原酸的濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]，如圖1，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=60.788X+0.002 1，r= 0.999 9，綠原酸濃度在4 μg/mL～40 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

2.1.4 精密度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取金銀花粉末0.250 0 g，按2.2項(xiàng)方法操作，重復(fù)測定5次，其吸光度分別為1.521 6、1.521 8、 1.521 5、1.521 9、1.522 1，RSD為0.02%。

2.1.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取金銀花粉末5份，各為0.250 0 g，按2.2項(xiàng)方法操作，其吸光度分別為1.492 1、1.493 8、1.491 4、1.489 6、1.489 0，RSD為0.44%。

2.1.6 回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知含量的金銀花粉末0.250 0 g 5份，加入不同量的綠原酸對照品，按按2.2項(xiàng)方法操作測定加樣回收率，依法重復(fù)測定3次，平均回收率為98.95%，RSD為1.17%。

2.1.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取金銀花粉末適量，按2.2項(xiàng)方法操作，每隔2小時(shí)測定1次，結(jié)果樣品溶液在14 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為1.44%。

2.2 樣品中綠原酸的提取及測定

將金銀花于35℃的干燥箱恒溫干燥24 h后，冷卻至室溫，然后用粉碎機(jī)粉碎（過60目篩）。準(zhǔn)確稱取0.250 0 g金銀花粉末于離心管中，加入適量的70%乙醇進(jìn)行超聲提取，將提取液離心，并取上層清液于25 mL容量瓶中，重復(fù)多次，用70%乙醇定容至刻度，再精取其1 mL于25 mL容量瓶中，定容至刻度。按2.1的方法測定其吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算提取液濃度，進(jìn)一步計(jì)算綠原酸提取量。改變不同提取條件，考察乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、提取功率和提取料液比對提取量的影響。

提取量（以綠原酸計(jì)，mg/g）=（C×V）/M

式中：C為樣液中綠原酸的含量，（mg/mL）；V為樣液的體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素超聲提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)討論

高中力學(xué)在現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)上發(fā)揮了重要作用，并且在社會各技術(shù)領(lǐng)域的實(shí)踐中得到了廣泛應(yīng)用和發(fā)展。在各項(xiàng)科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展的時(shí)代潮流中，高中力學(xué)融合各領(lǐng)域技術(shù)，促進(jìn)了人類社會的歷史性進(jìn)步。隨著科學(xué)技術(shù)更深入的發(fā)展，很多人們沒有涉足的領(lǐng)域也將會有人類的痕跡。高中力學(xué)在這些領(lǐng)域同樣會發(fā)揮其巨大的科技價(jià)值，為人類造福。

3.1.1 乙醇濃度對綠原酸提取效果的影響

適宜的溶劑濃度會有利于有效成分的溶解，可縮短提取時(shí)間，增加提取效率。準(zhǔn)確稱取7份金銀花粉末各0.250 0 g于離心管中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%、100%的乙醇溶液8 mL，在45℃和超聲功率為1000W的情況下超聲浸提2.0h，離心，取上層清液按2.1.3的方法測定綠原酸的濃度。從而得到綠原酸提取效果與乙醇濃度的關(guān)系。結(jié)果如圖2所示。

由圖2結(jié)果可知，在乙醇質(zhì)量分量為30%～70%之間，綠原酸的提取量隨乙醇濃度增大而增大，并在70%時(shí)達(dá)到最大值，之后隨乙醇濃度的增大提取量反而減少。根據(jù)相似相容原理，可能是由于乙醇濃度增大，醇溶性物質(zhì)競爭溶解，導(dǎo)致了綠原酸的溶解度下降。因此，在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，綠原酸的提取效果最好。

3.1.2 提取溫度對綠原酸提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取0.250 0 g金銀花粉末于離心管中，分別加入8 mL 70%的乙醇溶液，分別在25、35、45、50、55、65℃的條件下，在1 000 W的超聲功率下超聲2.0 h，離心，取上層清液，測定綠原酸濃度，計(jì)算提取量，從而確定較適宜的提取溫度，結(jié)果如圖3所示。

圖2 乙醇濃度對綠原酸提取效果的影響Fig.2 Effect of alcohol concentration on the yield of chlorogenic acid

圖3 超聲溫度對綠原酸提取效果的影響Fig.3 Effects of temperature on extraction rate of chlorogenic acid

由圖3結(jié)果可知，溫度過低不利于綠原酸的浸出，提取量較低，較高的提取溫度能促進(jìn)分子的熱運(yùn)動(dòng)，使溶劑和溶質(zhì)分子之間的交換速度加快，這樣更有利于增加綠原酸的浸出，從而增加了提取量。但是綠原酸是熱敏性物質(zhì)，過高的溫度會使綠原酸分解而被破壞，導(dǎo)致提取量降低。因此最佳的提取溫度為50℃。

3.1.3 料液比對綠原酸提取效果的影響

以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的乙醇為溶劑，準(zhǔn)確稱取0.250 0 g金銀花粉末，分別以不同總料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL的條件下，并在50℃和1 000 W的超聲功率下提取2.0 h，測定金銀花中綠原酸的含量，從而確定不同料液比和提取量的關(guān)系，結(jié)果如圖4所示。

圖4 液料比對綠原酸提取效果的影響Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of chlorogenic acid

由圖4結(jié)果可知，料液比較小時(shí)，綠原酸提取不充分，隨著乙醇用量的不斷增加，綠原酸有效成分的提取量也在不斷增加，但乙醇溶液用量過大其他組分溶解反而不利于綠原酸的提取。從圖4可知當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)提取效果最好。

3.1.4 超聲時(shí)間對綠原酸提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取0.250 0 g金銀花粉末于離心管中，分別加入5 mL 70%的乙醇溶液，并在50℃和1 000 W的超聲功率下分別超聲0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h。離心，取上層清液，測定綠原酸濃度，計(jì)算提取量，從而以確定最佳提取時(shí)間，結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲時(shí)間對綠原酸提取效果的影響Fig.5 Effects of extracting time on extraction rate of chlorogenic acid

由圖5的結(jié)果可知，隨著提取時(shí)間的增加，提取量不斷增加，在1.5 h時(shí)綠原酸提取量達(dá)到最大值，之后再增加提取時(shí)間并沒有得到較高的提取量。提取時(shí)間短綠原酸不能充分溶解出來，時(shí)間過長，其他組分被提取出來，可能影響提取效果，因此最佳提取時(shí)間為1.5 h。

3.1.5 超聲功率對綠原酸提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取0.250 0 g金銀花粉末于離心管中，分別加入5 mL 70%的乙醇溶液，并在50℃和1.5 h的條件下分別以300、500、700、900、1 100 W的超聲功率進(jìn)行操作。離心，提取上層清液，測定綠原酸濃度，計(jì)算提取量。從而確定適宜的超聲功率，如圖6所示。

由圖6可知，隨著超聲功率的增加，其綠原酸的提取量不斷增加，但到700 W處后提取量趨于穩(wěn)定。再增加功率對綠原酸的提取量影響不大。從經(jīng)濟(jì)的角度考慮其最佳的提取功率取700 W為宜，其提取效率為7.64%，提取量為76.4 mg/g。

圖6 超聲功率對提取效果的影響Fig.6 Effects of ultrasonic power on extraction rate of chlorogenic acid

3.2 超聲提取金銀花中綠原酸的正交試驗(yàn)討論

在綠原酸的提取過程中，乙醇濃度、提取溫度、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率等因素都影響綠原酸的得率。根據(jù)綠原酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以及傳統(tǒng)提取經(jīng)驗(yàn)，選用超聲功率700 W情況下，對其余4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，L9（34）即三水平四因素模式。其中4個(gè)因素分別為超聲時(shí)間（A）、提取溫度（B）、料液比（C）和乙醇濃度（D）。以綠原酸得率為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，其因素水平及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見表1、表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2Results of orthogonal test

由表2可以看出，極差R4>R1>R3>R2，得到各因素影響提取量的主次順序?yàn)镈>A>C>B，即乙醇濃度、超聲時(shí)間、料液比，其次是溫度。所以乙醇濃度是影響金銀花中綠原酸提取量的主要因素。由正交試驗(yàn)k值可知，最優(yōu)組合為A2B3C2D2。即超聲時(shí)間為1.5 h，提取溫度為55℃，料液比為1∶20（g/mL），乙醇濃度為70%。3.3結(jié)果驗(yàn)證分析

在最優(yōu)組合A2B3C2D2條件下，做3次平行實(shí)驗(yàn)，考察金銀花中綠原酸提取率的最優(yōu)水平條件，其結(jié)果見表3所示。

表3 最優(yōu)組合條件下的結(jié)果驗(yàn)證Table 3Results of the best extraction conditions

由表3結(jié)果可知，在最優(yōu)組合條件下，通過3組平行試驗(yàn)驗(yàn)證，可得金銀花中綠原酸的平均提取率為7.887%。

4 結(jié)論

以川產(chǎn)道地中藥材金銀花為原料和乙醇水溶液為溶劑，利用正交試驗(yàn)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化參考，通過大量的單因素水平實(shí)驗(yàn)，以綠原酸得率為指標(biāo)，考察了超聲波提取金銀花中綠原酸的不同條件對提取效果的影響，獲得的最佳提取條件為：乙醇濃度為70%，浸提溫度為55℃，料液比為1∶20（g/mL），超聲時(shí)間為1.5 h，超聲功率為700 W，其綠原酸得率為7.887%。

本工藝操作簡便，提取條件溫和，提取效率高，同時(shí)乙醇成本低，可回收利用，環(huán)保經(jīng)濟(jì)。因此此法可為金銀花中提取綠原酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

[1]國家藥典委員會.中華人名共和國藥典(2005版第一部)[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:152-153

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Process Optimization of Ultrasonic Extraction of Chlorogenic Acid in Honeysuckle Flower

HUANG Xiao-mei1，2，DENG Xiang1，2，WU Di1，2
（1.Department of Chemistry and Chemical Engineering，Sichuan University of Arts and Science，Dazhou 635000，Sichuan，China；2.Key Laboratory of the Research on Characteristic Plants of Universities in Sichuan Province，Sichuan University of Arts and Science，Dazhou 635000，Sichuan，China）

Extraction of chlorogenic acid from Honeysuckle Flower was studied systematically.The ultrasonic method assisted extraction of chlorogenic acid，the effect of factors was investigated and the optimal parameters were determined as follows：the concentration of ethanol was 70%，leaching temperature was 55℃，the ratio of Honeysuckle Flower to ethanol was 1∶20（g/mL），time was 1.5 h，ultrasonic power was 700 W.The use of UV spectrophotometry for detection of chlorogenic acid products.In the 328 nm wavelength，obtained the maximum peak of chlorogenic acid，was 7.887%calculated.

Honeysuckle Flower；chlorogenic acid；extraction process；orthogonal experiment；ultrasonic method

2013-08-21

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.010

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目資助（11ZA169;13ZA0101）；達(dá)州市科技局重點(diǎn)項(xiàng)目資助（JCYJ1119）

黃小梅（1977—），女（漢），副教授，碩士，主要研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。