響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提啤酒花多糖的工藝研究

張占軍，葛洪，鄭倩倩，陳慧，王春云

（揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)生物與化工工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

響應(yīng)面法優(yōu)化熱水浸提啤酒花多糖的工藝研究

張占軍，葛洪，鄭倩倩，陳慧，王春云

（揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)生物與化工工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

研究篩選啤酒花多糖的熱水浸提最佳提取工藝條件。以浸提溫度、料液比、浸提時(shí)間及浸提次數(shù)作為影響因素，以啤酒花多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)四因素三水平Box-Behnken中心組合試驗(yàn)，建立多糖提取率的二次多項(xiàng)式回歸方程，經(jīng)響應(yīng)面回歸分析得到優(yōu)化組合條件。啤酒花多糖提取最優(yōu)條件最終確定為：提取溫度91℃，液料比14 mL/g，提取時(shí)間104 min以及提取次數(shù)2次。在該條件下多糖提取率實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值間存在較好的一致性。所得二元多次回歸方程是準(zhǔn)確的且適用于對(duì)啤酒花中多糖的提取進(jìn)行預(yù)測(cè)。

響應(yīng)面法；啤酒花；多糖；提取

啤酒花（Humulus Lupulus L.）又名忽布（英語(yǔ)俗名Hop）、香蛇麻花、酒花、野酒花，?？撇輰俣嗄晟试荼局参铩Ｋ且环N較耐寒不耐熱的植物，主要分布于我國(guó)西北地區(qū)、新疆北部、東北、華東及山東、甘肅、陜西等地[1]。啤酒花的主要用途是用于啤酒釀造，但隨著近年來(lái)對(duì)啤酒花研究的深入，啤酒花中新的生物和藥理活性成分不斷被發(fā)現(xiàn)，已從中分離和鑒定出了400多種化合物這些化合物中的生物和藥理活性成分結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系也已逐漸被探明，而與其他研究相比，對(duì)啤酒花中的糖類物質(zhì)的研究相對(duì)薄弱，已發(fā)表的相關(guān)性文獻(xiàn)數(shù)量非常有限，有關(guān)其中所含糖類化合物的組成和結(jié)構(gòu)信息的研究鮮見(jiàn)報(bào)道[2]。多糖廣泛存在于植物、微生物（真菌和細(xì)菌）、藻類和動(dòng)物體，目前多糖的研究已成為天然藥物及食品研發(fā)的重要組成部分。響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）是一種優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)的有效方法，廣泛應(yīng)用于化學(xué)化工、生物工程、食品工業(yè)等工藝條件方面的優(yōu)化[3-7]。它與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法不同，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)，并能夠通過(guò)相應(yīng)圖尋求在整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。本工作擬在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法對(duì)啤酒花多糖（HLP）提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用啤酒花提供實(shí)驗(yàn)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒花：由新疆龍潤(rùn)啤酒花有限公司提供；石油醚（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇（分析純），上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備（只標(biāo)注主要的）

DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；5804R型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；DS-1型高速組織搗碎機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；Alpha 1-2型冷凍干燥機(jī)：英國(guó)LABCONCO公司。

1.3 提取工藝流程

啤酒花→80℃烘干至恒重→粉碎（孔篩0.5 mm）→石油醚回流脫脂（液料比3，時(shí)間3 h）→55℃烘干→80%乙醇回流→65℃烘干→粉碎→加水?dāng)嚢杞帷x心（5 000 r/min，10 min）→上清液濃縮→加乙醇至75%終濃度→靜止過(guò)夜→抽濾→濾渣→冷凍干燥

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 啤酒花多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[8]。

1.4.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取經(jīng)105℃干燥恒重的葡萄糖500 mg，稀釋定容至100 mL，從中取出1 mL溶液加蒸餾水定容至50 mL，此時(shí)葡萄糖濃度為0.1 mg/mL,精密吸取以上濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液各0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL，分別置于20 mL的比色管中，再依次加入蒸餾水使終體積為2 mL，同時(shí)吸取2 mL蒸餾水于比色管中作空白對(duì)照，然后在以上各管中加入5%苯酚1 mL，搖勻后立即加入5 mL濃硫酸，振蕩，室溫放置20 min后，用分光光度計(jì)在490.0 nm處測(cè)定其吸光值。

1.4.3 啤酒花多糖得率的計(jì)算

取干燥啤酒花多糖10 mg，定容至100 mL，吸取樣品液1.0 mL，加入1 mL蒸餾水，按1.4.2操作，測(cè)光密度。

多糖得率Y（%）=（WE×CT）/WP×100

式中：WE為的粗提取物的重量，g；WP為每次實(shí)驗(yàn)中使用的預(yù)處理樣品重量，g；CT為粗提取物中總糖的含量，%。

1.5 單因素實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用水提醇沉法提取啤酒花多糖，分別考察浸提溫度、料液比、浸提時(shí)間及浸提次數(shù)對(duì)啤酒花多糖得率的影響。

1.6 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

基于單因素實(shí)驗(yàn)確定的各變量范圍，利用Design-Expert軟件（version7.1.1，Stat-Ease Corporation, USA）進(jìn)行四因素三水平Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素的實(shí)驗(yàn)水平及編碼列于表1。

表1 啤酒花多糖提取響應(yīng)面分析因素水平表Table 1Factors and levels of Box-Benhnken design test on HLP extraction conditions

以提取溫度、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為自變量，啤酒花粗多糖的提取率為響應(yīng)值。表2列出Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模型及其響應(yīng)值，整個(gè)實(shí)驗(yàn)共計(jì)31組，其中中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)7組。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模型及其響應(yīng)值Table 2Box-Behnken design matrix and the response values for the yield of HLP

續(xù)表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)模型及其響應(yīng)值Continue table 2Box-Behnken design matrix and the response values for the yield of HLP

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（苯酚-硫酸法）Fig.1 The standard curve of glucose determined by phenolsulfuric acid

2.2 啤酒花多糖單因素實(shí)驗(yàn)提取工藝條件的選擇

2.2.1 浸提溫度對(duì)啤酒花多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取啤酒花干品5.0 g，按料液比1∶12浸泡后，在60、70、80、90、100℃5個(gè)不同溫度下，通過(guò)恒溫磁力攪拌器浸提90 min，浸提1次后測(cè)定多糖含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 浸提溫度對(duì)啤酒花多糖得率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on Yield of HLP

由圖2可知，不同提取溫度對(duì)啤酒花多糖得率有較大影響，溫度過(guò)低，不利于多糖物質(zhì)的溶出；溫度過(guò)高，容易引起多糖降解。在一定提取范圍內(nèi)，啤酒花多糖得率隨著浸提溫度的升高而增大，得率達(dá)到最大值，但超過(guò)一定范圍后，隨著溫度的上升，多糖反而有下降的趨勢(shì)，綜合考慮，選擇浸提溫度為90℃為最佳浸提溫度。

2.2.2 料液比對(duì)啤酒花多糖得率的影響

取經(jīng)預(yù)處理的啤酒花粉碎干品5.0 g，在提取溫度90℃條件下，以1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20 5個(gè)不同的料液比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，平行實(shí)驗(yàn)3次，確定料液比對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 液料比對(duì)啤酒花多糖得率的影響Fig.3 Effects of ratio of water to material on Yield of HLP

由圖3可知，料液比較小和較大時(shí)，多糖得率都有一些偏低，較小時(shí)可能是因?yàn)槿軇┝可偈沟梦锪献兊谜吵?，從而影響了多糖得率；較大時(shí)可能是因?yàn)槿軇┝看蠼o濃縮帶來(lái)不便，從而導(dǎo)致多糖得率降低。因此，綜合考慮，選擇料液比1∶12為最佳料液比。

2.2.3 浸提時(shí)間對(duì)啤酒花多糖得率的影響

取經(jīng)預(yù)處理的啤酒花粉碎干品5.0 g，在浸提溫度90℃，以1∶12的料液比，在30、60、90、120、150 min 5個(gè)不同的時(shí)間條件下，確定浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，啤酒花多糖得率先逐漸增大，再逐漸降低，這可能是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，加快了細(xì)胞的破裂，從而使啤酒花多糖更好的溶解到水中，多糖得率增大。但時(shí)間超過(guò)90 min之后，得率增加不明顯，而且時(shí)間的延長(zhǎng)可能使啤酒花多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，同時(shí)綜合成本考慮，提取時(shí)間在90 min左右為宜。

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)啤酒花多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取啤酒花粉碎干品5.0 g，在90℃浸提溫度下，以1∶10的料液比進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)恒溫磁力攪拌器浸提90 min，分別浸提1、2、3、4、5次后計(jì)算多糖含量，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 浸提時(shí)間對(duì)啤酒花多糖得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on Yield of HLP

圖5 提取次數(shù)對(duì)啤酒花多糖得率的影響Fig.5 Effects of extraction times on Yield of HLP

由圖5可知，提取次數(shù)的增多能提高啤酒花多糖的得率，但提取3次后，殘?jiān)卸嗵呛棵黠@降低，再增加提取次數(shù)已無(wú)實(shí)際意義，故從節(jié)省能耗、減少操作工序以及經(jīng)濟(jì)性考慮，優(yōu)化時(shí)提取次數(shù)的考察水平分別取1次，2次及3次為宜。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化啤酒花多糖提取工藝的選擇

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到以下二元多次回歸方程：

Y=2.551 4+0.105 8X1+0.150 0X2+0.114 2X3+ 0.061 6X4-0.007 5X1X2-0.050 0X1X3-0.030 0X1X4+ 0.092 5X2X3-0.035 0X2X4-0.035 0X3X4-0.251 9X1X1-0.210 7X2X2-0.151 9X3X3+0.048 2X4X4

其中Y表示提取物中多糖的含量，X1、X2、X3、X4分別是被測(cè)變量提取溫度、液料比、提取時(shí)間、浸提次數(shù)的編碼值。

利用Design-Expert軟件對(duì)上述多元回歸模型進(jìn)行方差分析（ANOVA）及統(tǒng)計(jì)顯著性和適合度檢驗(yàn)，結(jié)果列于表3。

表3 多元回歸模型方差分析表Table 3Analysis of variance（ANOVA）for the Response Surface Quadratic Model

從表2可以看出，F(xiàn)-檢驗(yàn)顯示回歸模型有較高的F值（F=9.1）和極低的P值（P＜0.000 1），表明本回歸模型是顯著的，變異系數(shù)（Coefficient of variation）是衡量各觀測(cè)值變異程度的一個(gè)統(tǒng)計(jì)量，本模型值為4.64，也表明該模型具有較高的精確性和良好的實(shí)驗(yàn)值可靠性[9]。決定系數(shù)（R2）反映出回歸模型的適合度，R2值越接近于1，則實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性越好[10]。本結(jié)果決定系數(shù)R2值等于0.888 6，表明啤酒花多糖得率的實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值間有較好的一致性；調(diào)整決定系數(shù)adj-R2等于0.791 0，說(shuō)明啤酒花多糖得率總變異中約79.10%是由獨(dú)立變量決定的。此外，失擬度（Lack of Fit）是衡量模型在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)不能代表的數(shù)據(jù)，不包括在模型中不能通過(guò)隨機(jī)誤差所解釋的回歸或者變化的數(shù)據(jù)[11]。本研究中，失擬度的F-值為4.04，p-值為0.050 6，失擬度相對(duì)于純誤差（pure error）是不顯著的，失擬度的不顯著使得回歸模型具有更高的適合度。預(yù)測(cè)殘差平方和（PRESS）為0.94，說(shuō)明模型解釋變差的能力較強(qiáng)，總體擬合具有統(tǒng)計(jì)顯著性[12]。

2.3.2 等高線圖和響應(yīng)曲面圖分析

響應(yīng)曲面圖（三維）和等高線圖（二維）是運(yùn)用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來(lái)，以供我們憑借直覺(jué)的觀察來(lái)了解各個(gè)變量實(shí)驗(yàn)值與響應(yīng)值之間的關(guān)系以及兩個(gè)被測(cè)變量間交互作用的類型，從而選擇試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)化條件。等高線圖的形狀（圓形或橢圓形）反應(yīng)了兩被測(cè)變量間交互作用顯著與否，橢圓形等高線表明兩被測(cè)變量間交互作用是顯著的，圓形等高線則意味著兩被測(cè)變量間交互作用不顯著，可以忽略不計(jì)[13]。

三維響應(yīng)面和二維等高線圖是回歸方程的圖形表示，本研究通過(guò)Design-Expert 7.1.1軟件模擬生成，如圖6及圖7所示。

圖6 各因素交互作用對(duì)啤酒花多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface plot showing the interactive effects of four extraction parameters on the extraction yield of polysaccharides

利用Design-Expert軟件，啤酒花多糖提取最優(yōu)條件最終確定為：提取溫度91.4℃，液料比13.7 mL/g，提取時(shí)間103.5 min以及提取次數(shù)2.3次。在此條件下，啤酒花多糖得率預(yù)測(cè)值為2.63%?？紤]到操作的方便性，最優(yōu)提取參數(shù)修正為提取溫度91℃，水料比14 mL/g，提取時(shí)間104 min以及提取次數(shù)2次。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，對(duì)啤酒花多糖提取工藝條件進(jìn)行了四因素三水平的響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，從而建立了響應(yīng)值和各因素之間的數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明，提取溫度、液料比、提取時(shí)間的一次項(xiàng)及其二次項(xiàng)對(duì)啤酒花多糖得率的影響顯著，而它們的交互項(xiàng)作用不明顯。

利用Design-Expert軟件，啤酒花多糖提取最優(yōu)條件最終確定為：提取溫度91℃，水料比14 mL/g，提取時(shí)間104 min以及提取次數(shù)2次。在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值間存在較好的一致性，說(shuō)明本研究所得二元多次回歸方程是準(zhǔn)確的且適用于對(duì)啤酒花中提取多糖進(jìn)行預(yù)測(cè)。

圖7 各因素交互作用對(duì)啤酒花多糖得率影響的等高線圖Fig.7 Contour plot showing the interactive effects of four extraction parameters on the extraction yield of polysaccharides

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Optimization of Hot Water Extraction of Polysaccharides from Humulus Lupulus L. by Response Surface Methodology

ZHANG Zhan-jun，GE Hong，ZHENG Qian-qian，CHEN Hui，WANG Chun-yun
（College of biological and chemical engineering，Yangzhou Vocational University，Yangzhou 225009，Jiangsu，China）

To optimize technology of hot water extract polysaccharides from Humulus Lupulus L.by response surface analysis.On the basis of single-factor experiments，the relationship between main extraction conditions including extraction temperature，ratio of water to material，extration time and extration times were modeled using a 4-factor，3-level Box-Behnken experimental design and studied the yield of polysaccharides.And then，the established model was analyzed by response surface methodology to obtain the optimum extraction conditions.The optimum extraction conditions were obtained as follows：extraction temperature，91℃；ratio of water to raw material，14 mL/g；extraction time，104 min；and extraction times，2.Under these conditions，the experimental value was well matched with value predicted by the model.The binary multiple regression equation is accurate and suitable for the extraction of polysaccharide from Humulus Lupulus L.

response surface methodology；Humulus Lupulus L.；polysaccharides；extraction technology

2013-07-08

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.008

江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自然科學(xué)基金）項(xiàng)目（BK20141269）；江蘇省高校大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新項(xiàng)目（2012JSSPITP4010）；江蘇省高校“青藍(lán)工程”資助（蘇教師[2012]39號(hào)）

張占軍（1977—），男（漢），副教授，博士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。