響應(yīng)法優(yōu)化南瓜中色素的提取工藝研究

于開源，鞠曉峰，鄭麗娜，孫清瑞，劉志明，李秀波

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319）

響應(yīng)法優(yōu)化南瓜中色素的提取工藝研究

于開源1，鞠曉峰2，鄭麗娜1，孫清瑞1，劉志明1，李秀波1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319）

以南瓜為原料，利用復(fù)合溶劑萃取南瓜中色素，并用響應(yīng)面法優(yōu)化南瓜中色素提取的工藝條件，得出最佳的溶劑配比為乙醇：水：石油醚。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取處理時(shí)間、處理溫度、石油醚用量為影響因子，以β-胡蘿卜素提取率為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果表明，南瓜中胡蘿卜色素提取的優(yōu)化工藝條件為：90 min、處理溫度40℃、石油醚用量40 mL，β-胡蘿卜素濃度為10.086 mg/g。與模型的預(yù)測值10.105 mg/g基本相符，響應(yīng)法優(yōu)化能夠提高南瓜色素提取率。

胡蘿卜素；南瓜；提取工藝；響應(yīng)面分析

南瓜含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，其中有多糖、蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、多種維生素和鈣、磷等。由于南瓜有較高的食用價(jià)值，并且還具有降糖[1-3]、降血脂[4]、抗癌[5-6]等作用，所以以南瓜為原料的功能性保健食品有著廣泛的應(yīng)用和發(fā)展空間[7-12]。胡蘿卜素廣泛的存在于動植物中，以胡蘿卜、辣椒、南瓜等蔬菜中含量最多，水果、谷類、蛋黃、奶油中也有存在。胡蘿卜色素主要有3種異構(gòu)體，α-、β-、γ-胡蘿卜素，其中β-胡蘿卜素是蔬菜、水果和動物體內(nèi)胡蘿卜素中一種最普遍的異構(gòu)體[12]。因此，從南瓜中提取色素不僅有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值而且還有食療和藥用價(jià)值，南瓜色素具有極大的市場潛力。

目前，從天然植物中提取β-胡蘿卜素的方法很多，其中主要是以溶劑提取法為主，其他的提取技術(shù)如干燥法、微波提取、超聲提取以及超臨界提取等[13]方法，除此外還有用生物方法提取的胡蘿卜提取β-胡蘿卜素。但是，這些方法要么是由于受到外界環(huán)境條件的限制，要么使得產(chǎn)量很低，要么對設(shè)備要求很高，使得工業(yè)化生產(chǎn)收率很低，因此多不甚理想，需要進(jìn)一步的研究和探討[14]。

本研究主要以南瓜為原料，采用復(fù)合溶劑對南瓜中的色素等有用成分進(jìn)行提取分離。利用響應(yīng)分析法[15-16]對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，探索影響提取的各因素的影響效果，以期望找出主要影響因素及提取β-胡蘿卜素的最佳工藝，為工業(yè)生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

市售南瓜（黑龍江省產(chǎn)落花面2 kg～3 kg），顏色為黃綠色，山東產(chǎn)小南瓜（0.2 kg～0.5 kg），紅南瓜（2 kg～3 kg）。

丙酮、無水乙醇、正己烷、乙酸乙酯、石油醚、無水硫酸鈉、氧化鋁（140℃條件下活化3 h），以上試劑均為分析純；標(biāo)準(zhǔn)β-胡蘿卜色素：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速組織搗碎機(jī)DS-1：上海標(biāo)本模型廠；T6新世紀(jì)—紫外線可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；723A可見分光光度計(jì)：上海精密儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用處真空泵：鄭州盛達(dá)儀器有限公司；TD4A臺式離心機(jī)：長沙英泰儀器有限公司；層析柱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 南瓜樣品選擇及物性的測定

將適量新鮮南瓜樣品切片，用高速組織搗碎機(jī)粉碎，用研缽磨碎，分別測定南瓜樣品中的水分、灰分和脂肪含量。

1.3.2 不同溶劑選擇

分別稱取南瓜樣品8 g，用50 mL丙酮、正乙烷、乙酸乙酯、石油醚為單萃取劑萃取、過濾、定容進(jìn)行比色實(shí)驗(yàn)。分別用1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2∶1不同比例的乙醇水溶液20 mL與上述比較最優(yōu)的有機(jī)溶劑40 mL組合，配制成復(fù)合溶劑，按上述方法萃取、取上層石油醚層，定容、比色得最優(yōu)溶劑。

1.3.3 南瓜中β-胡蘿卜色素的提取

新鮮南瓜→清洗→破碎→粉碎成漿→準(zhǔn)確稱量→溶劑浸提→離心→清液上層過層析柱→濃縮定容→測定樣品中β-胡蘿卜色素→計(jì)算其含量。

準(zhǔn)確稱取南瓜樣品8 g放入具塞瓶中，加入乙醇水溶液中，遮光萃取一定時(shí)間，分3次加入石油醚振蕩，靜止一段時(shí)間后過濾，吸取上層石油醚層，過無水硫酸鈉及氧化鋁層析柱，濃縮定容即為提取液、待測，水和乙醇層中可以做為提取水溶性多糖使用。

1.3.4 南瓜中β-胡蘿卜色素最大吸收波長的測定

稱取適量的南瓜按1.3.2節(jié)方法制成樣品，在200nm～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定其在可見光范圍內(nèi)的最大吸收波長。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取β-胡蘿卜色素標(biāo)準(zhǔn)樣品20 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用石油醚定容，搖勻。取此溶液10 mL置于100 mL棕色容量瓶中，用石油醚定容，此溶液濃度為20 mg/L。然后分別配置成濃度為20、40、60、80、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液，定容后搖勻。經(jīng)全波段波長掃描可知，胡蘿卜中的胡蘿卜素吸收峰在451 nm，在451 nm處測定其吸光度，以胡蘿卜色素質(zhì)量濃度對吸光度作圖，確定胡蘿卜色素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 單因素試驗(yàn)

1.3.6.1 提取時(shí)間的影響

將提取時(shí)間分別設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，溫度25℃條件下，乙醇的水溶液20 mL，石油醚用量為40 mL條件下進(jìn)行提取。

1.3.6.2 提取溫度的影響

將提取溫度分別設(shè)置為20、30、40、50、60℃，提取時(shí)間為1.5h，乙醇的水溶液20mL，石油醚用量為40mL條件下進(jìn)行提取。

1.3.6.3 石油醚用量的影響

將提取溫度分別設(shè)置為20、30、40、50、60 mL，提取時(shí)間為1.5 h，提取溫度40℃，乙醇的水溶液20 mL，石油醚用量為40 mL條件下進(jìn)行提取。

1.3.7 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果：提取時(shí)間90 h、提取溫度40℃、石油醚體積40 mL，以β-胡蘿卜色素提取率為測定指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。提取溫度、提取時(shí)間，石油醚體積3個因素為自變量，分別以A、B、C表示，以-1、0、1代表各自變量的低、中、高水平。利用Design Expert軟件分析確定最優(yōu)提取工藝參數(shù)，設(shè)計(jì)方案見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1Factors and levels in central composite design

1.3.8 β-胡蘿卜色素提取率的計(jì)算

式中：Y為南瓜中β-胡蘿卜色素得率，（μg/g）；y為樣品定容后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的色素含量，（g/mL）；M為原料的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜樣品的物性測定

按上述提取、分析方法，分別測定所選3種南瓜樣品的水分、脂肪含量、灰分和β-胡蘿卜色素含量，結(jié)果見表2。

表2 不同品種南瓜中水分、脂肪含量、灰分及和β-胡蘿卜色素含量（n=3）Table 2Contents of moisture，fat，ash and β-carotene in different pumpkin cultivars（mean±SE）

由表2可知，落花面、小南瓜、紅南瓜脂肪含量與β-胡蘿卜素含量呈正相關(guān)，這是由于β-胡蘿卜色素屬于油性色素，不同品種的體內(nèi)脂肪含量不同，直接影響β-胡蘿卜色素含量，故提取品種選擇上可以先初步測定其中脂肪含量，選擇脂肪含量高的作為我們提取的主要原料。

2.2 提取溶劑的選擇

提取溶劑的選擇見表3。

表3 提取溶劑種類的選擇Table 3Selection of solvents in extraction

從表3可以看出，β-胡蘿卜色素在有機(jī)溶劑中溶解效果比極性溶劑中溶解效果好，正己烷和石油醚中其提取效果都相對較好，考慮石油醚的性質(zhì)和經(jīng)濟(jì)性故選石油醚做有機(jī)相進(jìn)行下步的復(fù)合溶劑實(shí)驗(yàn)。

選擇落花面南瓜品種，分別準(zhǔn)確稱取8 g，分別以乙醇：水：石油醚的混合體系，提取β-胡蘿卜色素提取效果以吸光度值為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表4。

從表4結(jié)果可以明顯得出，乙醇：水體積比為1∶2條件下，與石油醚復(fù)配，提取β-胡蘿卜素效果最好。2.3最大吸收波長的測定

以提取溶劑為反應(yīng)液體作空白，測得不同波長下，提取液的吸光度，以不同吸收波長為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)做圖，最大吸收波長的測定見圖1。

表4 不同乙醇：水—石油醚體積配比下的提取樣品的吸光度Table 4Absorbency of β-carotene in different proportion of ethanol：water and petroleum

圖1 南瓜色素、β-胡蘿卜色素全波長掃描圖Fig.1 Full wavelength scanning spectrum map of pumpkin and β-carotene

由圖1可以看出南瓜中色素主要以β-胡蘿卜色素為主，其中還有些其它色素，南瓜中兩峰值分別出現(xiàn)在445 nm和472 nm處，而β-胡蘿卜色素標(biāo)樣峰值出現(xiàn)在451 nm處，查閱相關(guān)文獻(xiàn)了解，β-胡蘿卜色素在450 nm附近有吸收峰，所以選用450 nm波長。

2.4 β-胡蘿卜色素的測定

以β-胡蘿卜色素標(biāo)樣濃度為X軸、吸光度為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，由標(biāo)準(zhǔn)曲線圖可得回歸方程y= 0.954 9x-0.055 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8，在10 μg/L～200 μg/L范圍內(nèi)有很好的相關(guān)性。

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 提取時(shí)間的對β-胡蘿卜色素得率的影響

提取時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，提取率結(jié)果見圖2。

圖2 提取時(shí)間對β-胡蘿卜色素得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of β-carotene

由圖2可知，隨著處理時(shí)間的延長β-胡蘿卜色素得率先增加后減少，0～1.5 h提取率隨時(shí)間呈正相關(guān)，從1.5 h～2.5 h提取率隨時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，提取時(shí)間1.5 h提取率最好，所以選擇處理時(shí)間為1.5 h。

2.5.2 提取溫度對β-胡蘿卜色素得率的影響

不同溫度下，吸光度為450 nm時(shí)，南瓜中β-胡蘿卜色素得率見圖3。

圖3 提取溫度對β-胡蘿卜色素得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of β-carotene

由圖3可知，隨著處理溫度的升高β-胡蘿卜素的濃度先逐漸增加后有所降低，溫度為40℃時(shí)，β-胡蘿卜素的濃度最高。

2.5.3 石油醚用量對β-胡蘿卜色素得率的影響

石油醚使用不同的體積時(shí)，吸光度為450 nm時(shí)，β-胡蘿卜色素得率見圖4。

圖4 石油醚提取體積對β-胡蘿卜色素得率的影響Fig.4 Effect of extraction volume of petroleum ether on the yield of β-carotene in pumpkin

由圖4可知，隨著石油醚用量的增大β-胡蘿卜色素的濃度先增加后緩慢減少，在40 mL時(shí)最高，所以石油醚量以40 mL為較好。

2.6 響應(yīng)法優(yōu)化南瓜中β-胡蘿卜色素的提取工藝參數(shù)

2.6.1 回歸方程的建立與方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，通過Design Expert數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行回歸分析，得到的方差分析結(jié)果如表6所示。

由表6可知，處理溫度和石油醚用量的一次項(xiàng)達(dá)到顯著水平（P＜0.05），處理時(shí)間的一次項(xiàng)未到顯著水平，表明處理溫度和石油醚用量對β-胡蘿卜素的得率線性效應(yīng)顯著；二次項(xiàng)對β-胡蘿卜素濃度的曲面效應(yīng)顯著；AC、BC交互效應(yīng)達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），表明各影響因素對β-胡蘿卜素濃度的影響不是簡單的線性關(guān)系。從表6的分析結(jié)果來看，整體模型的P＜ 0.01，該二次方程模型達(dá)到極顯著水平，并且失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說明該回歸方程對數(shù)據(jù)進(jìn)行了較好擬合，二次回歸方程為：

Y=10.06+0.16A-0.35B-0.49C+0.17AB-1.19AC-1.40BC-1.18A2-1.19B2-3.46C2

2.6.2 響應(yīng)面及等高線分析結(jié)果

響應(yīng)面圖是響應(yīng)值在各試驗(yàn)因素交互作用下得到的結(jié)果構(gòu)成的一個三維空間曲面。根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀。圖5、6是對響應(yīng)值β-胡蘿卜素濃度影響較大的兩因素交互作用的結(jié)果，圖7交互作用不顯著。

表5 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 5Experimental scheme and results of centralcomposite design

表6 回歸模型方差分析Table 6Variance analysis of the regression equation for the yield xylan

圖5 提取時(shí)間和石油醚量對β-胡蘿卜素的濃度交互影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots the effects of extraction time and volume of petroleum ether on the yield of β-carotene in pumpkin

圖6 提取溫度和石油醚量對β-胡蘿卜素的濃度交互影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots the effects of extraction temperature and volume of petrolem ether on the yield of β-carotene in pumpkin

圖7 處理溫度和處理時(shí)間對β-胡蘿卜素的濃度交互影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots the effects of extraction temperature and time ether on the yield of β-carotene in pumpkin

由圖5可知，處理時(shí)間在60 min～90 min范圍內(nèi)，石油醚用量在30 mL～40 mL范圍內(nèi)時(shí)，兩者存在顯著的增效作用，β-胡蘿卜素濃度隨著處理時(shí)間和石油醚用量的增加而增加；而處理時(shí)間在90 min～120 min范圍內(nèi)，石油醚用量在40 mL～50 mL范圍內(nèi)時(shí)，β-胡蘿卜素濃度隨著2個因素的增加反而開始降低。由圖6可知，處理溫度在30℃～40℃范圍內(nèi)，石油醚用量在30 mL～40 mL范圍內(nèi)時(shí)，兩者存在顯著的增效作用，β-胡蘿卜素濃度隨著處理時(shí)間和石油醚用量的增加而增加；而處理溫度在40℃～50℃范圍內(nèi)，石油醚用量在40 mL～50 mL范圍內(nèi)時(shí)，β-胡蘿卜素濃度隨著2個因素的增加反而開始降低。

為了確定最佳點(diǎn)的值，對模型進(jìn)行分析，以得到最高β-胡蘿卜素濃度的最佳提取工藝條件，經(jīng)分析得出最佳提取條件為處理時(shí)間92.90 min、處理溫度38.75℃、石油醚用量38.67 mL，β-胡蘿卜素濃度為10.105 mg/g。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的可靠性，采用上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行南瓜中胡蘿卜素的提取，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的便利，最佳條件修正為處理時(shí)間90 min、處理溫度40℃、石油醚用量40 mL，β-胡蘿卜素濃度為10.086 mg/g。與預(yù)測值比較可知，響應(yīng)面法所得的優(yōu)化工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

在對南瓜提取溶劑的選取上，采用復(fù)合溶劑提取使提取率明顯增大，得出最佳的復(fù)配溶劑為：乙醇：水：石油醚，且剩余的乙醇相可以做水溶性副產(chǎn)物的提取所用，得到乙醇：水的最佳配比濃度為1∶2。采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行響應(yīng)面分析結(jié)合實(shí)際值確定胡蘿卜素提取的最佳工藝條件為處理時(shí)間93 min、處理溫度40℃、石油醚用量40 mL，β-胡蘿卜素濃度為10.086 μg/mL。處理溫度和石油醚量對β-胡蘿卜素的濃度影響顯著，處理時(shí)間的影響不顯著；處理時(shí)間與石油醚用量和處理溫度與石油醚用量的交互項(xiàng)對β-胡蘿卜素濃度的曲面效應(yīng)顯著。

[1]賀小瓊.南瓜的營養(yǎng)與保健[J].中國食物與營養(yǎng),2003(8):43-46

[2]熊學(xué)敏,石揚(yáng),康明,等.南瓜多糖降糖有效部位的提取分離及降糖作用研究[J].中成藥,2000,22(8):563-565

[3]車千紅,呂敏,段寶珊,等.南瓜粉配合臨床治療糖尿病療效觀察[J].遼寧藥物與臨床,2002,11,5(4):201-204

[4]?；燮?南瓜多糖的降血脂作用研究[J].生物學(xué)雜志,2008(3):57-58

[5]Kune GA,Bannerman S,Field B,et al.Diet,alcohol,smoking, serum β‐carotene,and vitamin A in male nonmelanocytic skin cancer patients and controls[J].Nutrition and Cancer,1992,18(3): 237-244

[6]Dutta D,Dutta A,Raychaudhuri U,et al.Chakraborty,R.,Rheological characteristics and thermal degradation kinetics of betacarotene in pumpkin puree[J].Journal of Food Engineering,2006, 76(4):538-546

[7]Provesi J G,Dias C O,Amante E R,et al.Changes in carotenoids during processing and storage of pumpkin puree[J].Food Chemistry, 2011,128(1):195-202

[8]Verica D-U,Karmela D,Branka L,et al.Phenolic profiles of raw apricots,pumpkins,and their pureesin the evaluation of apricot nectar and jam authenticity[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53:4836-4852

[9]田秀紅,劉鑫峰,姜燦.南瓜的營養(yǎng)保健作用與產(chǎn)品開發(fā)[J].食品研究與開發(fā),2009(2):169-172

[10]羅雙群,張桂紅,陳海偉,等.南瓜功能特性研究進(jìn)展[J].糧食與油脂,2012(4):47-49

[11]Arima H K,Rodrhuez-Amaya D B.Carotenoid composition and vitamin A value of a squash and a pumpkin from Northeastern Brazil [J].Archivos Latinoamericanos de Nutrición,1990,40(2):284-292

[12]FU Caili,SHUN Huan,LI Quanhong.A review on pharmacological activities and utilization technologies of pumpkin[J].Plant Foods for Human Nutrition,2006,61(2):70-77

[13]王歲樓.提高紅酵母胡蘿卜素制品水溶性的研究[J].食品科學(xué), 2002,23(5):79-80

[14]Kurz C,Carle R,Schieber A.HPLC-DAD-MSn characterisation of carotenoids from apricots and pumpkins for the evaluation of fruit product authenticity[J].Food Chemistry,2008,110(2):522-530

[15]Yu L,Ramaswamy H,Boye J.Twin-screw Extrusion of Corn Flour and Soy Protein Isolate(SPI)Blends:A Response Surface Analysis [J].Food and Bioprocess Technology,2012,5(2):485-497

[16]Lago-Vanzela E S,do Nascimento P,Fontes E A F,et al.Edible coatings from native and modified starches retain carotenoids in pumpkin duringdrying[J].LWT-FoodScienceandTechnology,2013, 50(2):420-425

[17]王海英,杜為民,李雯,等.螺旋藻干粉中β-胡蘿卜素提取工藝研究[J].中國食物與營養(yǎng),2010(6):64-66

[18]Yu L,Ramaswamy H,Boye J.Twin-screw Extrusion of Corn Flour and Soy Protein Isolate(SPI)Blends:A Response Surface Analysis [J].Food and Bioprocess Technology,2012,5(2):485-497

Response Surface Methodology Optimization of β-Carotene in Pumpkin Extraction Process

YU Kai-yuan1，JU Xiao-feng2，ZHENG Li-na1，SUN Qing-rui1，LIU Zhi-ming1，LI Xiu-bo1
（1.College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China；2.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，Heilongjiang，China）

Taking pumpkin as raw material，using the composite solvent extraction of pumpkin and response surface methodology was applied to optimize of the extraction of carrot pigment from pumpkin.Based on single factor experiment，selection of processing time，temperature，petroleum ether used as impact factor，and the β-Carotene concentration was selected as response value and the mathematical model was established by Boxbehnken central composite design.The optimal fermentation conditions were determined as follows：processing time 90 min，treatment temperature 40℃，petroleum ether dosage was 40 mL.Through verification experiment numerical 10.086 mg/g.With the model of the predictive value of 10.105 mg/g basically，response method optimization can improve the extraction rate of pigment from pumpkim.

carotene；pumpkin；extraction process；response surface analysis

2013-10-21

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.007

于開源（1978—），女（漢），講師，碩士，研究方向：食品物理化學(xué)、食品安全檢測。