無(wú)孔兩性離子交換色譜固定相的制備及其應(yīng)用

鄭慶忠，卜春苗，龔波林

（1.寧夏大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，寧夏銀川 750021；2.寧夏大學(xué)天然氣轉(zhuǎn)化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，寧夏銀川 750021）

高效液相色譜（HPLC）已發(fā)展成為分離和分析生物大分子的強(qiáng)有力手段。在色譜分離時(shí)，減少分離時(shí)間來(lái)保持蛋白的生物活性是非常必要的[1]，無(wú)孔類型的快速高效液相色譜固定相應(yīng)運(yùn)而生。這類填料的主要優(yōu)點(diǎn)是其克服了傳統(tǒng)多孔填料中的停滯流動(dòng)相傳質(zhì)，由于顆粒小，剛性好，對(duì)改善柱效，提高樣品的質(zhì)量回收，保持溶質(zhì)的生物活性十分有利，特別適合于生物大分子的分離與快速分析[2-3]。

兩性離子色譜材料是一種在同一材料內(nèi)同時(shí)存在陰陽(yáng)兩種交換基團(tuán)，被廣泛應(yīng)用于分離分析無(wú)機(jī)陰陽(yáng)離子[4-5]。首次報(bào)道的兩性交換材料用于蛋白質(zhì)的分離是Jiang[6]通過(guò)化學(xué)鍵合法將兩性基團(tuán)鍵合到大孔硅膠表面，可同時(shí)分離酸性和堿性蛋白，效果較好，但其存在的弊端是以硅膠為基質(zhì)，大大限制了其pH 應(yīng)用范圍。

本文是在已有的研究[7]基礎(chǔ)上，以自合成的3.0 μm無(wú)孔單分散親水性PGMA/EDMA微球?yàn)榛|(zhì)，通過(guò)新的化學(xué)鍵合法制備得到了一種兩性離子交換色譜填料（ZIC）。詳細(xì)考察了ZIC 型固定相的分離性能，流速等對(duì)蛋白質(zhì)保留的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該填料是一種性能優(yōu)異的離子交換樹脂，能同時(shí)分離酸性和堿性，特別適合于生物大分子的快速分離純化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 ZIC 樹脂的合成

稱取3.0 g 無(wú)孔PGMA/EDMA（微球I）樹脂放入100 mL三頸瓶中，加入到40 mL 的二甲胺溶液中，60 ℃回流反應(yīng)20 h。產(chǎn)物用水、丙酮和乙醇反復(fù)洗滌，真空60 ℃，得微球II。將微球II 分散于120 mL 的乙睛中，并加入2.5 g 1，3-丙磺酸內(nèi)酯，于80 ℃回流攪拌24 h，產(chǎn)物用丙酮和乙醇洗滌數(shù)次，真空干燥，即可制得一種新型的兩性離子交換色譜填料（Zwitterionic exchange packings，ZIC）（微球III），合成路線（見圖1）。

1.2 ZIC 填料的裝填

以水為勻漿液，在28 MPa 壓力下以勻漿法裝柱，不銹鋼柱管：5×0.46 cm I.D.。

1.3 色譜測(cè)試條件

10 min 線性梯度（100 %A～100 %B），流動(dòng)相：A 液（平衡液）：20 mmol/L LPBS（pH=5），B 液（洗脫液）：A+1.0 mol/L NaCl（pH=5），檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。

1.4 前沿色譜法測(cè)定ZIC 填料的動(dòng)態(tài)吸附容量

使用5×0.46 cm I.D.的ZIC 柱，在流動(dòng)相為20 mmol/L PBS+1.5 mg/mL Lys（BSA），流速為0.5 mL/min 的條件下，采用前沿突破曲線法，測(cè)定了該ZIC 柱填料的動(dòng)態(tài)吸附容量。

1.5 快速分離純化重組人粒細(xì)胞-巨嗤細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）包涵體

rhG-CSF 包涵體的提?。悍Q取一定量的rhG-CSF菌體，加入一定量緩沖液，在冰浴條件下超聲波破碎儀破碎菌體，4 ℃，18 000 r/min 離心15 min，棄去上清液，收集包涵體。按體積比為包涵體質(zhì)量：7 mol/L Gu·HCl=1：30 的比例，研磨，加入7.0 mol/L Gu·HCl 溶液。在4 ℃攪拌放置17 h 后，18 000 r/min 離心15 min，取上清液直接用所合成的ZIC 色譜分離純化rhG-CSF。

2 結(jié)果及討論

2.1 ZIC 柱色譜性能的考察

為了考察在本論文中所制備的ZIC 柱的色譜性能，在pH=5.0 的緩沖體系中，運(yùn)用制備的ZIC 柱，選取等電點(diǎn)pI 大于7.0 堿性蛋白：Myo（pI 7.3），RNase-A（pI 8.8），Cyt-C（pI 9.4），Lys（pI 11.0），及pI 小于7.0 酸性蛋白：BSA（4.9），OVA（4.7）和Ins（5.3）作為目標(biāo)物質(zhì)來(lái)驗(yàn)證其在ZIC 柱上的保留行為，最終驗(yàn)證酸性蛋白和堿性蛋白在ZIC 柱上均有保留。這是由于在本論文中所合成的ZIC 樹脂表面帶有磺酸基與氨基，在合適的色譜條件下，分別能與堿性和酸性蛋白發(fā)生靜電作用而保留，符合兩性色譜柱的特性。圖2 可以證明，在合適的條件下，ZIC 柱可以對(duì)4 種堿性蛋白達(dá)到基線分離（見圖2）。

圖1 ZIC 色譜填料的合成路線

圖2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白在ZIC 柱上的分離圖（5×0.46 cm I.D.）

2.2 ZIC 柱對(duì)蛋白的快速分離

在本實(shí)驗(yàn)中，選取無(wú)孔填料為基質(zhì)，其存在的最大優(yōu)勢(shì)是顆粒度小，特別有利于生物大分子在其表面快速傳質(zhì)，從而能達(dá)到快速分離。圖3（b）中可以看出，ZIC 柱在流速為2 mL/min 時(shí)，4 min 內(nèi)可達(dá)到對(duì)4 種堿性蛋白的基線分離。與圖3 中（a）相比較可以看出，柱效與1 mL/min 時(shí)的柱效基本相同，實(shí)驗(yàn)證明所合成的無(wú)孔填料，具備了高效和快速分離的特征。

2.3 ZIC 填料的動(dòng)態(tài)吸附容量

圖3 蛋白在ZIC 柱上的分離圖

對(duì)于分離技術(shù)中大規(guī)模制備的需要，動(dòng)態(tài)吸附曲線能夠?yàn)榉蛛x介質(zhì)的動(dòng)力學(xué)鍵合量提供有價(jià)值的信息。所以本論文中通過(guò)測(cè)定填料的動(dòng)態(tài)吸附容量來(lái)評(píng)價(jià)色譜柱的分離純化性能具有一定的意義。本文選用Lys（流動(dòng)相：20 mmol/L NaH2PO4+1.5 mg/mL Lys，流速為0.5 mL/min）和BSA（流動(dòng)相：20 mmol/L NaH2PO4+1.5 mg/mL BSA，流速為0.5 mL/min）為考察蛋白，測(cè)定所合成的ZIC 填料的動(dòng)態(tài)吸附容量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出在突破點(diǎn)為5%時(shí)，該ZIC 填料的動(dòng)態(tài)吸附容量BSA為26.4 mg/mL，Lys 為37.6 mg/mL，結(jié)果比較滿意（見圖4）。

2.4 ZIC 柱應(yīng)用研究

人粒細(xì)胞-巨嗤細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）屬于造血生長(zhǎng)因子，主要來(lái)源于巨嗤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及纖維母細(xì)胞。發(fā)酵表達(dá)所得的重組人粒細(xì)胞-巨嗤細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）與大量的雜蛋白混雜在一起，增加了復(fù)性和分離純化的難度。rhG-CSF 的等電點(diǎn)為6.0，適宜于運(yùn)用本實(shí)驗(yàn)中選合成的ZIC 柱進(jìn)行純化。用ZIC 柱對(duì)rhG-CSF 樣品進(jìn)行了一步分離純化的色譜圖（見圖5）。圖5 中目標(biāo)峰（*）為rhG-CSF，純度由純化前的30 % 提高到87 %。實(shí)驗(yàn)證明，用所合成的ZIC 柱，選擇合適的色譜條件，rhG-CSF 和其他蛋白得到了很好的分離，純化后的rhG-CSF 具有較高的純度。表明所合成的ZIC 柱具有優(yōu)良的兩性離子交換色譜性能，可以滿足對(duì)生物大分子的分離純化。

圖4 BSA 和Lys 吸附量測(cè)定突破曲線圖

圖5 快速分離純化重組人粒細(xì)胞-巨嗤細(xì)胞集落刺激因子的色譜圖（*為rhG-CSF）

3 結(jié)論

離子交換色譜法具有廣泛的應(yīng)用范圍，特別是在分離生物大分子分離純化中具有重要的意義。本文以3.0 μm 無(wú)孔單分散PGMA/EDMA樹脂為基質(zhì)，用新的化學(xué)改性方法合成了一種親水性良好的兩性離子交換色譜（ZIC）填料。結(jié)果表明，所報(bào)道的ZIC 柱可達(dá)到同時(shí)對(duì)酸性和堿性蛋白的保留，并適宜于對(duì)蛋白的快速分離純化。

［1］ Sun Guoyong，Shi Qinghong，Sun Yan. J Chromatogr. A，2004，1061：159.

［2］ 趙慶香，閻虎生，何炳林.高效液相色譜的動(dòng)力學(xué)增強(qiáng)填料［J］.離子交換與吸附，1998，14（3）：275.

［3］ 楊樹明，田秀蘭，蘇天升.非多孔樹脂的高效液相色譜填料及其對(duì)蛋白質(zhì)的分離性能［J］.分析化學(xué)研究報(bào)告，1997，25（2）：130.

［4］ Sugrue E，Pavel N，Nesterenko，et al. Fast ion chromatography of inorganic anion and cations on a lysinebonded porous silica monolith［J］.J Chromatogr A，2005，1075：167-175.

［5］ Twohill E，Paull B. Zwitterionic ion chromatography using a dynamically coated column and mobile phase recycling［J］.J Chromatogr A，2002，973：103-113.

［6］ Jiang Wand Irgum K.Synthesis and Evaluation of Polymer-Based Zwitterionic Stationary Phases for Separation of Ionic Species［J］.Anal. Chem，2001，73：1993-2003.

［7］ Zhu Jinxia，Bo Chunmiao，Gong Bolin. Preparation of Strong Cation Exchange Packings Based on Monodisperse Hydrophilic Non-porous Resins and Their Application for Fast Separation of Proteins［J］.China J Chromatogr，2006，24（2）：129-134.