糖皮質(zhì)激素受體基因多態(tài)性與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性研究

劉 瑜，方 放，黃 方

·論 著·

糖皮質(zhì)激素受體基因多態(tài)性與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性研究

劉 瑜，方 放，黃 方

目的 探討華東漢族人群糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）基因多態(tài)性與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性。方法 共募集膿毒癥患者194例。以連接酶檢測反應(yīng)（ligase detection reaction，LDR）技術(shù)對(duì)GR基因中的15個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。非條件Logistic回歸，校正年齡、性別、吸煙、飲酒、APACHEⅡ評(píng)分后，在不同遺傳模式下分析各基因型與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸（器官功能障礙、休克、死亡）的相關(guān)性。結(jié)果 rs9324924 GT／TT攜帶者與GG攜帶者相比較，可能降低重度器官功能障礙風(fēng)險(xiǎn)（OR［95%CI］＝0．39［0．16～0．99］，P＝0．047）；rs4912905 CG／CC攜帶者與GG攜帶者相比較，發(fā)生重度器官功能障礙風(fēng)險(xiǎn)增加（OR［95%CI］＝2．53（0．99～6．50），P＝0．047）；rs9324921 CA／AA攜帶者與發(fā)生膿毒性休克的風(fēng)險(xiǎn)是CC攜帶者的2．47倍（OR［95%CI］＝2．47（1．04～5．84），P＝0．038）。未發(fā)現(xiàn)與膿毒癥死亡相關(guān)的位點(diǎn)。結(jié)論 GR基因單核苷酸多態(tài)性可能與華東漢族人群膿毒癥后器官功能障礙和休克發(fā)生相關(guān)。

膿毒癥；糖皮質(zhì)激素受體；單核苷酸多態(tài)性；臨床轉(zhuǎn)歸

膿毒癥為感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，其發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明。已有研究表明，遺傳因素在膿毒癥及其他多種疾病的發(fā)生及多樣化的臨床轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用［1?3］。了解膿毒癥發(fā)生的遺傳因素，有助于對(duì)危重患者早期診斷并施行個(gè)體化治療，提高膿毒癥患者存活率。糖皮質(zhì)激素受體（GR）屬于核受體超家族成員，其本質(zhì)是配體調(diào)控的核轉(zhuǎn)錄因子。GR與糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）結(jié)合后，通過多種機(jī)制抑制炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)過程［4?7］。GR遺傳變異可能影響GR的功能，影響其對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)能力。攜帶相關(guān)變異型的患者易產(chǎn)生過度炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為對(duì)膿毒癥易感或預(yù)后不良。本研究以GR基因?yàn)楹蜻x基因，分析中國華東漢族人群中GR基因單核苷酸多態(tài)性（nucleotide polymorphism，SNP）與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性，為危重膿毒癥患者早期診療提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 自2014年2月－2015年2月，連續(xù)收集南京軍區(qū)南京總醫(yī)院呼吸科收治的由肺部感染導(dǎo)致的膿毒癥患者194例。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2001年美國胸科醫(yī)師學(xué)會(huì)和危重病醫(yī)學(xué)會(huì)制定的膿毒癥診斷和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)?；颊叩娜脒x標(biāo)準(zhǔn)為∶①年齡≥14周歲；②漢族，籍貫為中國華東地區(qū)（江蘇、浙江、安徽、上海），相互間無生物學(xué)親緣關(guān)系；③膿毒癥診斷明確，且原發(fā)感染灶為肺部；④病史資料和臨床實(shí)驗(yàn)室檢查和輔助檢查結(jié)果齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)∶①入院后24 h內(nèi)死亡；②具有其他特殊疾病，如獲得性免疫缺陷綜合征、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、器官移植后等；③曾攝入或應(yīng)用過對(duì)炎癥過程有調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，如TNF?α抗體、INF?γ等；④接受免疫抑制劑和激素治療；⑤孕婦。采用調(diào)查表收集患者的社會(huì)人口學(xué)資料、既往史、吸煙、飲酒史、實(shí)驗(yàn)室檢查和輔助檢查資料及膿毒癥診斷基本指標(biāo)、診斷膿毒癥后24 h內(nèi)急性生理和慢性健康評(píng)分系統(tǒng)（acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ）評(píng)分，住院期間多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）最高評(píng)分（參照Marshall MODS評(píng)分系統(tǒng)）、臨床轉(zhuǎn)歸（器官功能障礙、休克、死亡）。所有入選病例抽取靜脈血3 mL，枸櫞酸鈉抗凝，－80℃保存?zhèn)溆?。所有受試者均簽署知情同意書。本研究?jīng)南京軍區(qū)南京總醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核通過。

1.2 方法

1.2.1 SNP位點(diǎn)的選擇 在Pubmed（http∶／／www．ncbi．nlm．nih．gov／pubmed／）上查閱已發(fā)表的有關(guān)GR基因多態(tài)性與疾病相關(guān)性研究的文獻(xiàn)，找到常見的SNP位點(diǎn)。查閱NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫（http∶／／www．ncbi．nlm．nih．gov／snp），找到位于基因功能區(qū)（外顯子、3′及5′非翻譯區(qū)）的SNP位點(diǎn)。從HapMap數(shù)據(jù)庫（http∶／／www．hapmap．org）中選擇北京漢族人群樣本，以r2＞0．8，作為條件，得到標(biāo)簽SNP（Tag SNP）。以上得到的SNP位點(diǎn)且在中國人群中次要等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）大于10%者為入選，最終選取15個(gè)SNP進(jìn)行研究（表1）。

1.2.2 基因分型 采用德國QIAGENTM試劑盒提取外周靜脈血DNA?；蚍中筒捎蒙虾Ｌ礻簧锟萍加邢薰靖牧嫉倪B接酶檢測反應(yīng)（LDR）分型方法。根據(jù)dbSNP數(shù)據(jù)庫提供的基因組序列自行設(shè)計(jì)引物。PCR過程中設(shè)置陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后隨機(jī)雙盲選取20個(gè)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)性檢驗(yàn)，重復(fù)率達(dá)100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS軟件（19．0版本，SPSS Inc．，Chicago，IL，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)每個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型頻率，進(jìn)行g(shù)oodness?of?fit χ2檢驗(yàn)，判斷是否符合Hardy?Weinberg平衡。連續(xù)變量的差異采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，分類變量采用χ2檢驗(yàn)。根據(jù)臨床轉(zhuǎn)歸將膿毒癥病例進(jìn)行分組∶①輕度器官功能障礙（MODS評(píng)分0～8分）和重度器官功能障礙組（MODS評(píng)分9～18分）；②膿毒癥休克和非休克組；③死亡和存活組。采用非條件Logistic回歸模型校正年齡、性別、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙、飲酒、慢性病狀態(tài)、APACHEⅡ評(píng)分等，在不同的遺傳模式下分析各位點(diǎn)基因型頻率與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)系，計(jì)算P值、比值比（odds ratio，OR）和95%置信區(qū)間（confidential inter?val，CI）。所有統(tǒng)計(jì)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 糖皮質(zhì)激素受體基因SNP位點(diǎn)信息

2 結(jié) 果

2.1 研究對(duì)象 共納入194名膿毒癥患者（表2），原發(fā)感染灶均為肺部，年齡16～95（61．90±18．47）歲，男性比例較高（63．92%）。痰培養(yǎng)以革蘭陰性菌（28．87%）和混合性感染（29．90%）多見，最常見的感染細(xì)菌為銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌。革蘭陽性菌感染（4．12%）中最常見的為金黃色葡糖球菌。單純真菌感染12例（6．19%），其中曲霉菌感染4例。住院期間并發(fā)重度器官功能障礙41例（21．13%）、膿毒性休克51例（26．29%），死亡57例（29．38%）。每兩組之間的社會(huì)人口學(xué)資料和臨床特征比較見表3～5。

2.2 GR基因多態(tài)性與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性 除rs4607376外，其他位點(diǎn)的頻率分布在本組病例中均符合Hardy?Weinberg平衡。rs6198在本研究膿毒癥病例中未檢測出突變型，故rs4607376和rs6198兩個(gè)位點(diǎn)未納入統(tǒng)計(jì)分析。校正年齡、性別、吸煙、飲酒、APACHE II評(píng)分后，非條件Logistic回歸分析顯示，rs9324924與膿毒癥器官功能障礙相關(guān)，GT／TT基因型較GG能夠降低重度器官功能障礙風(fēng)險(xiǎn)（OR［95%CI］＝0．39［0．16～0．99］，P＝0．047）；rs4912905 CG／CC基因型較GG發(fā)生重度器官功能障礙風(fēng)險(xiǎn)增加1．53倍（OR［95%CI］＝2．53（0．99～6．50），P＝0．047）（表6）。rs9324921 CA／AA基因型發(fā)生膿毒性休克的風(fēng)險(xiǎn)是CC的2．47倍（OR［95%CI］＝2．47（1．04～5．84），P＝0．038）（表7）。在本研究中，未發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)與膿毒癥死亡有關(guān)。

表2 膿毒癥患者臨床特征

表3 輕度和重度器官功能障礙患者臨床特征比較

表4 休克與非休克患者臨床特征比較

表5 存活與死亡患者臨床特征比較

表6 糖皮質(zhì)激素受體基因多態(tài)性與膿毒癥器官功能障礙的相關(guān)性［n（%）］

表7 糖皮質(zhì)激素受體基因多態(tài)性與膿毒性休克的相關(guān)性［n（%）］

3 討 論

GR基因位于人染色體5q31?q32，含有9個(gè)外顯子。根據(jù)對(duì)第9個(gè)外顯子mRNA剪切方式的不同，產(chǎn)生α、β兩種異構(gòu)體，GC的抗炎作用主要是通過GR?α介導(dǎo)的。當(dāng)GC與GR結(jié)合后發(fā)生同源二聚化，在細(xì)胞核內(nèi)通過多種機(jī)制抑制炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)（如TNF?α、IL?1等）［4?7］，即GR基因是調(diào)控炎性細(xì)胞因子生成的上游基因。GR基因突變或多態(tài)性可影響GR功能，導(dǎo)致個(gè)體間炎癥反應(yīng)的差異和對(duì)GC治療的敏感性。因此，GR基因是膿毒癥遺傳學(xué)因素研究的候選基因。既往GR基因多態(tài)性與肥胖、高血壓病、血脂紊亂、支氣管哮喘、慢性支氣管炎、特發(fā)性關(guān)節(jié)炎等的關(guān)系已有報(bào)道，但與膿毒癥的相關(guān)性尚未見報(bào)道［8?10］。本研究首次研究了中國華東漢族人群中GR基因多態(tài)性與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性。

研究報(bào)道最多的與感染或炎癥相關(guān)的GR基因SNP位點(diǎn)位于外顯子9 β3'UTR區(qū)的rs6198（G＜A）。該位點(diǎn)GG基因型在荷蘭人群能夠降低鼻腔內(nèi)金黃色葡糖球菌定植風(fēng)險(xiǎn)［11］，與白種人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病相關(guān)［12］，能增加白種人老年人群IL?6和超敏CRP水平［13］。在本研究膿毒癥病例中未檢測到rs6198突變型，與有關(guān)中國漢族急性淋巴細(xì)胞白血病兒童的檢測結(jié)果一致，考慮該位點(diǎn)在中國漢族人群中的突變頻率遠(yuǎn)較白種人低，故該位點(diǎn)無法進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，有待于進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。Panek等［14］報(bào)道rs10052957與喘息型慢性支氣管炎發(fā)病有關(guān)，Kostik等［15］發(fā)現(xiàn)rs41423247與白種人女孩幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎發(fā)病年齡和炎癥反應(yīng)水平有關(guān)，而在本研究中這兩個(gè)位點(diǎn)與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸均無相關(guān)。考慮原因是由于選擇壓力的存在，不同人群基因SNP存在較大差異，同時(shí)由于入選病例數(shù)量、感染病原體的差異和不同環(huán)境因素的作用，導(dǎo)致有些位點(diǎn)在其他人群報(bào)道中與感染或炎癥有關(guān)，而在本研究人群中為陰性結(jié)果。

因膿毒癥的發(fā)生與多種遺傳因素有關(guān)，可能涉及多個(gè)基因變異，因此我們未采取既往研究只選擇位于編碼區(qū)或啟動(dòng)子區(qū)的1個(gè)或幾個(gè)SNP進(jìn)行研究，而是綜合3種方法選擇更廣范圍的SNP位點(diǎn)（15個(gè)），最大程度的代表了GR基因上常見遺傳信息。這些位點(diǎn)中的大多數(shù)在既往關(guān)聯(lián)研究中都未見報(bào)道。結(jié)果表明，rs9324924 GT／TT基因型較GG型能夠降低重度器官功能障礙風(fēng)險(xiǎn)；rs4912905 CG／CC基因型較GG型發(fā)生重度器官功能障礙風(fēng)險(xiǎn)增加；rs9324921 CA／AA基因型發(fā)生膿毒性休克的風(fēng)險(xiǎn)比CC型高，提示GR基因變異與膿毒癥相關(guān)，有關(guān)基因型可能成為膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸的預(yù)警指標(biāo)。3個(gè)陽性位點(diǎn)均位于內(nèi)含子中（見表1），研究表明內(nèi)含子區(qū)突變可能通過影響mRNA的剪切、穩(wěn)定性或定位來影響基因的功能［16］。但不排除這些陽性位點(diǎn)因和其他與膿毒癥有關(guān)的SNP位點(diǎn)連鎖，而表現(xiàn)出與膿毒癥相關(guān)。因此對(duì)于本研究得到的陽性位點(diǎn)還要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，以了解其具體機(jī)制。

總之，GR基因多態(tài)性可能與膿毒癥臨床轉(zhuǎn)歸相關(guān)。深入了解GR基因多態(tài)性影響膿毒癥的機(jī)制，不僅有助于進(jìn)一步理解膿毒癥的發(fā)病機(jī)制，還可以根據(jù)患者的基因型，對(duì)高?；颊哌M(jìn)行早期、個(gè)體化治療，以期研制出療效更好、副作用更小的GR激活劑，為膿毒癥治療提供新的思路。

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（收稿日期∶2015?07?15；修回日期∶2015?08?23）

（本文編輯∶齊 名； 英文編輯∶王建東）

Association of polymorphisms in glucocorticoid receptor with outcome of sepsis in a Chinese Han population

LIU Yu，F(xiàn)ANG Fang，HUANG Fang． Department of Geriatrics，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Geriatric Research Center of Nanjing Military Command，Nanjing，Jiangsu 210002，China

Objective To explore the association of glucocorticoid receptor（GR）gene polymorphisms with outcome of sepsis in Eastern China population．Methods Total of 15 single nucleotide polymorphisms（SNPs）were classified by genotype in 194 septic patients using LDR technology．Unconditioned logistic regression analysis was used to explore the association of GR gene polymorphisms with outcome（organ dysfunction／shock／death）of sepsis after adjusting for age，sex，smoking and drinking status and APACHEⅡscore．Results Compared with GG genotype，the rs9324924GT／TT reduced severity of organ dysfunction with OR value of 0．39（95% CI∶0．16－0．99，P＝0．047）．The rs4912905 CG／CC genotype increased the risk of severe organ dysfunction compare with GG genotype（OR［95%CI］＝2．47［1．04－5．84］，P＝0．038）．The CA／AA genotype of rs9324921 polymorphism were significantly overrepresented among septic shock patients compared with controls（OR［95%CI］＝2．47［1．04－5．84］，P＝0．038）．However，there were no associa?tions between polymorphisms of GR gene and death of sepsis．Conclusion Genetic polymorphisms in GR gene are thought to associate with severity of organ failure and shock after sepsis．

sepsis；glucocorticoid receptor；single nucleotide polymorphism；clinical outcome

R631．2

A

10．3969／j．issn．1672?271X．2015．06．005

∶2015?07?20；

∶2015?09?17）

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院院管課題（2014068）

210002江蘇南京，南京軍區(qū)南京總醫(yī)院干部二科，南京軍區(qū)老年病研究中心

黃 方，E?mail∶88100224＠qq．com