金櫻子乙醇提取物抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

李 玲，孟英才，肖水平，譚 洋，廖美芳，裴 剛*（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

金櫻子乙醇提取物抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

李 玲，孟英才，肖水平，譚 洋，廖美芳，裴 剛*
（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

目的對(duì)金櫻子乙醇提取物進(jìn)行抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究。方法用β-胡蘿卜素-亞油酸漂白法，DPPH和NO自由基清除實(shí)驗(yàn)來衡量金櫻子乙醇提取物的抗氧化活性；用α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)來測(cè)定金櫻子乙醇提取物抑制α-葡萄糖苷酶的活性。結(jié)果金櫻子乙醇提取物隨著濃度增加抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性逐漸增大，但弱于陽性對(duì)照品。結(jié)論金櫻子乙醇提取物具有較好的抗氧化和一定的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，并且有助于將來進(jìn)一步開發(fā)利用金櫻子。

金櫻子，乙醇提取物，抗氧化；α-葡萄糖苷酶

金櫻子(Rosa laevigata Michx.)是薔薇科薔薇屬植物,又名糖罐子、糖橘子、山石榴、刺梨子、刺榆子、燈籠果等[1]。金櫻子喜陽，生長(zhǎng)在山野、田間和河畔等灌木叢中。在我國分布廣泛，主要產(chǎn)于湖南、江西、浙江、江蘇、廣東、廣西和安徽等地。金櫻子擁有多種藥用價(jià)值，它的根能活血化瘀、排毒收斂，葉子可以消腫止痛，果實(shí)可利尿補(bǔ)腎。金櫻子具有多種藥用價(jià)值歸根于其含有的多種生物活性物質(zhì)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，金櫻子含有豐富的化學(xué)成分，包括多種維生素、微量元素、多糖、黃酮、三萜等[2-3]。多糖、黃酮和三萜類化合物是許多藥用植物的有效成分，具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤和抗衰老等生物活性。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，糖尿病是一個(gè)患病率高的慢性終身性疾病，以血糖持續(xù)升高為主要特征[4]。2000年全球糖尿病患者已經(jīng)超過1.7億，并逐年呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。糖尿病可以引起多種并發(fā)癥，如糖尿病腎病、糖尿病眼部并發(fā)癥、糖尿病足等。目前，治療糖尿病的途徑多種多樣，其中抑制α-葡萄糖苷酶能夠有效降低餐后血糖的升高。另一方面，糖尿病可以引起機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化狀態(tài)的改變，如糖尿病機(jī)體的血漿脂質(zhì)過氧化物含量增加，抗氧化酶活力下降[5]。生物體在氧化應(yīng)激下，機(jī)體產(chǎn)生的自由基使體內(nèi)氧化與還原不平衡，造成氧化損傷，誘發(fā)各種疾病[6]。所以抗氧化、清除自由基能夠減少多種疾病的發(fā)生發(fā)展。

金櫻子中豐富的化學(xué)成分，具有多種生物活性。將金櫻子乙醇提取物進(jìn)行抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定，對(duì)其預(yù)防與治療糖尿病及其并發(fā)癥具有重要意義。本文采用β-胡蘿卜素漂白法、DPPH 和NO自由基清除實(shí)驗(yàn)來衡量金櫻子乙醇提取物的抗氧化活性，用α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)來測(cè)定金櫻子乙醇提取物抑制α-葡萄糖苷酶的活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

金櫻子果實(shí)切碎去掉種子于55℃干燥而成。β-胡蘿卜素 (Sigma),DPPH (1,1-二苯基-2-苦基肼基，梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司)，硝普鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，α-葡萄糖苷酶(solarbio),其他均為分析純?cè)噭?/p>

紫外分光光度儀UV1800PC（上海美譜達(dá)）。

1.2 方法

1.2.1 金櫻子乙醇提取物的制備 2 kg干燥金櫻子用80%乙醇浸泡24 h，過濾，濾液減壓回收，得到金櫻子乙醇提取物50 g，用于活性測(cè)定。

1.2.2 β-胡蘿卜素-亞油酸漂白法 β-胡蘿卜素是一種多烯色素，易被氧化而退去黃色，在反應(yīng)介質(zhì)中，亞油酸氧化產(chǎn)生過氧化物能使β-胡蘿卜素氧化褪色，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度越小。抗氧化劑可以抑制β-胡蘿卜素氧化褪色。參照文獻(xiàn)[7]，精密稱取0.2 mg β-胡蘿卜素溶于1 mL氯仿中，加入20 mg亞油酸和100 mg吐溫-80。混合均勻后，減壓除去氯仿，加入50 mL蒸餾水，劇烈震蕩，配成反應(yīng)介質(zhì)溶液。同時(shí)設(shè)置空白組，不加β-胡蘿卜素，其他步驟同前。向試管中加入0.2 mL的樣品溶液，濃度0.1～1 mg/mL,加入5 mL反應(yīng)介質(zhì)溶液，在50℃條件下水浴90 min。用紫外分光光度計(jì)，在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定0 min和90 min的吸光度值。每個(gè)濃度平行測(cè)定3次?？寡趸钚缘挠?jì)算公式：

AC(0)=0 min對(duì)照品的吸光度值；AC(90)= 90 min對(duì)照品的吸光度值；AS(90)=90 min樣品的吸光度值。

1.2.3 DPPH法 DPPH在溶液中是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，用于抗氧化成分的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)。按照文獻(xiàn)[8]的方法稍加修改。將2 mL不同濃度的樣品乙醇溶液（0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL）和2 mL DPPH溶液(1×10-4mg/mL)加入同一玻璃具塞試管中搖勻，在室溫下密閉靜置20 min，用乙醇作為參比，用紫外分光光度計(jì)，在517 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。每個(gè)濃度平行3次。DPPH自由基清除公式：

A0為樣品的吸光度；A1為不加樣品時(shí)DPPH的吸光度；A2為加了樣品后DPPH溶液的吸光度。

1.2.4 NO法 按照文獻(xiàn) [9]的方法稍加修改。取1 mL硝普鈉溶液(5 mM)和1 mL不同濃度的樣品乙 醇 溶 液 混 勻 （0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL），29℃溫浴3 h。對(duì)照組無樣品，其他同上。完畢后，加入1 mL格里斯試劑（包含1%對(duì)氨基苯磺酸，0.1%1-萘胺和2%磷酸的水溶液），搖勻，用紫外分光光度計(jì)，在550 nm條件下測(cè)定紫外吸收。每個(gè)濃度平行測(cè)3次。NO自由基清除公式：

Ac對(duì)照品的吸光度值；As樣品的吸光度值。

1.2.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性 α-葡萄糖苷酶能將4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)水解產(chǎn)生4-硝基苯酚 (pNP)，pNP在水溶液中顯黃色，在405 nm有最大吸收，通過測(cè)定pNP在405 nm的吸光度大小來判定脂肪酶的活力[10]。取pH6.8磷酸緩沖液配成的α-葡萄糖苷酶（1U/mL）溶液500 μL，與100 uL不同濃度的金櫻子乙醇提取物溶液(16、31、63、125、250、500 ug/mL)混勻，50℃條件下水浴10 min，加入500 μl 4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷(0.3 mg/mL),50℃條件下水浴30 min，用紫外分光光度計(jì)在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。以阿卡波糖為陽性對(duì)照。每個(gè)濃度平行測(cè)3次。α-葡萄糖苷酶抑制活性公式：

A0為樣品的吸光度；A1為不加樣品時(shí)酶催化后的吸光度；A2為加了樣品酶催化后的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-胡蘿卜素-亞油酸漂白法

β-胡蘿卜素的褪色程度與抗氧化劑的抗氧化能力有關(guān)，抗氧化能力越強(qiáng)，褪色越少，吸光度值越大。根據(jù)公式(1)計(jì)算抗氧化活性，樣品的抗氧化活性越強(qiáng)，樣品組的吸光度值越大，即AS(90)越大，抑制率越大。由圖1可以看出，在低濃度條件下，隨著金櫻子乙醇提取物濃度的增大，抗氧化活性逐漸加大。當(dāng)濃度大于4 mg/mL時(shí)，抑制率幾乎不增加。金櫻子乙醇提取物的抗氧化活性比槲皮素的抗氧化活性低。

圖1 金櫻子乙醇提取物對(duì)β胡蘿卜素的漂白作用

2.2 DPPH法

研究表明，機(jī)體產(chǎn)生的自由基能引起多種慢性疾病。在體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，能使細(xì)胞膜、DNA和脂質(zhì)體等生物大分子損傷，從而引發(fā)炎癥、臟器病變和腫瘤等多種疾病。自由基是引起氧化反應(yīng)重要物質(zhì)，所以清除自由基是抗氧化研究的不可缺少的部分。DPPH自由基在517 nm有最大紫外吸收，隨著抗氧化物質(zhì)濃度的增加，DPPH自由基被清除的越多，吸光度值越小，根據(jù)公式(2)，計(jì)算的清除率越大。從圖2可以看出，金櫻子乙醇提取物清除DPPH自由基能力與濃度呈正相關(guān)，但低于維生素C。 在實(shí)驗(yàn)測(cè)定的濃度范圍內(nèi)，清除率的增加斜率沒有減少。

圖2 金櫻子乙醇提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用

2.3 NO法

NO自由基是機(jī)體內(nèi)重要的自由基，是神經(jīng)傳遞的信號(hào)分子，能使血管平滑肌松弛等作用。NO自由基在體內(nèi)分布廣泛，當(dāng)機(jī)體平衡失調(diào)，產(chǎn)生過量的NO自由基，會(huì)損傷細(xì)胞，引起炎癥、癌癥和其他疾病。所以使用NO自由基清除劑可以有效減少由NO自由基過量分泌產(chǎn)生的疾病。金櫻子乙醇提取物是成分多的混合物，由NO自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出（如圖3），金櫻子乙醇提取物的NO自由基清除率隨濃度的增大而增大，但相同濃度下低于維生素C。圖中金櫻子乙醇提取物曲線的斜率大于維生素C的斜率，在測(cè)定的高濃度下幾乎接近維生素C的清除率。

圖3 金櫻子乙醇提取物對(duì)NO自由基的清除作用

2.4 α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶抑制劑能在消化道中抑制α-葡萄糖苷酶，減少葡萄糖的釋放，進(jìn)而抑制葡萄糖的吸收，能在源頭上減少血糖的升高。由公式(4)計(jì)算樣品的抑制率，與α-葡萄糖苷酶抑制能力成正比。

由圖4可以看出，金櫻子乙醇提取物有較弱的α-葡萄糖苷酶抑制活性，從曲線的斜率上看，抑制活性與濃度呈正相關(guān)。并且在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，抑制率遠(yuǎn)低于相同濃度下的阿卡波糖。

圖4 金櫻子乙醇提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

3 結(jié)論

天然的、低毒的植物藥越來越受科學(xué)家的關(guān)注與人們的青睞。金櫻子乙醇提取物是一類成分復(fù)雜的天然混合物。用β-胡蘿卜素-亞油酸漂白法，DPPH和NO自由基清除實(shí)驗(yàn)來衡量金櫻子乙醇提取物的抗氧化活性；用α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)來測(cè)定金櫻子乙醇提取物抑制α-葡萄糖苷酶的活性，結(jié)果說明了金櫻子乙醇提取物有較好的抗氧化活性和一定的α-葡萄糖苷酶抑制作用。可能由于其成分復(fù)雜，導(dǎo)致抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性低于對(duì)照品。同時(shí)也說明了金櫻子在天然降糖藥和抗氧化劑方面極具開發(fā)潛力。

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（本文編輯 匡靜之）

Antioxidative Activity and α-Glucosidase Inhibitory Activity of Ethanol Extract in Rosa laevigata Michx.

LI Ling,MENG Yingcai,XIAO Shuiping,TAN Yang,LIAO Meifang,PEI Gang*
（Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo study antioxidative activity and α-glucosidase inhibitory activity of ethanol extract from Rosa laevigata Michx. (R.laevigata).MethodsThe antioxidative activity of ethanol extract from R.laevigata were determinated by β-carotene-linoleic acid bleaching,DPPH and NO scavenging assay.And the α-glucosidase inhibitory activity of ethanol extract from R.laevigata was measured by α-glucosidase inhibitory assay.Results The ethanol extract from R.laevigata showed strong antioxidant activity and possessed α-glucosidase inhibiting capacity following the concentration increased,but the activities were lower than positve control.ConclusionIt was evident that the ethanol extract from R.laevigata showed certain antioxidant activity and α-glucosidase inhibiting capacity.It may be used for the future research on R.laevigata.

Rosa laevigata,ethanol extract,antioxidation,α-glucosidase

R284

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2015.12.004

2015－11－23

湖南省衛(wèi)生廳225人才培養(yǎng)資助項(xiàng)目；2015年長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃項(xiàng)目資助。

李 玲，女，副教授，主要從事天然產(chǎn)物新藥研究與開發(fā)。

*裴 剛，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:peigang@hotmail.com。