錫林浩特某牧場奶牛乳房炎致病菌分離鑒定

梁 薇

(錫林郭勒職業(yè)學(xué)院，026000)

本試驗主要以錫林浩特某牧場為試驗對象，采集50份患有臨床型乳房炎奶牛的奶樣和50份患有隱性乳房炎奶牛的奶樣，進(jìn)行致病菌的分離、鑒定，生化鑒定和藥敏試驗。本試驗為指導(dǎo)臨床合理用藥和提高奶牛乳房炎防治效果提供了相關(guān)的理論依據(jù)，也為系統(tǒng)開展奶牛乳房炎致病菌的分子流行病學(xué)調(diào)查、血清學(xué)分型和耐藥性研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1培養(yǎng)基

普通的瓊脂培養(yǎng)基，SS瓊脂培養(yǎng)基，西檬氏枸櫞酸鹽培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯，高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基，三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基，血液瓊脂培養(yǎng)基，伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基。

1.2試劑

葡萄球菌屬細(xì)菌生化鑒定管，鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管，腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管；藥物敏感紙片。

2 實驗方法

2.1樣品采集

2015年6月，在錫林浩特某牧場采集100份奶牛乳樣，50份為臨床型乳房炎奶牛的乳樣，50份為隱性乳房炎的乳樣，這100份乳樣都符合《動物疾病實驗室檢驗手冊》的采集標(biāo)準(zhǔn)。對于患有臨床型乳房炎的奶牛，可以通過觀察奶牛的乳房情況，是否有發(fā)熱、疼痛和腫脹現(xiàn)象，另外還可以觀察患牛的乳汁，看乳汁中是否有絮片或者是凝塊和血奶，診斷確認(rèn)為臨床型乳房炎以后采集奶樣。對于患有隱性乳房炎的奶牛使用CMT檢測法檢測奶牛的乳樣，經(jīng)確認(rèn)為隱性乳房炎以后進(jìn)行奶樣采集。采集乳樣的時候，先用碘伏對專業(yè)人員進(jìn)行消毒，然后通過對酒精棉進(jìn)行相關(guān)的脫碘處理，實現(xiàn)對前三把奶的處理，最終實現(xiàn)對無菌操作的進(jìn)一步實現(xiàn)，在對五六毫升的奶樣進(jìn)行處理的過程中放到了十毫升的無菌試管當(dāng)中，使得乳頭最終能夠避免對采樣管的解除，最終將奶樣放到沐浴球上帶回實驗室中進(jìn)行理論分析。

2.2致病菌分離鑒定

2.2.1分離培養(yǎng)

充分搖動采集的奶樣，然后用滅菌的生理鹽水進(jìn)行稀釋，最后用滅菌的棉簽涂在普通瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行接種。將這些接種有乳樣的培養(yǎng)基放在37℃的恒溫箱里面培養(yǎng)24h～48h，挑選出比較典型的菌落進(jìn)行涂片和革蘭染色，再做鏡檢。按照菌落的形態(tài)、染色后出現(xiàn)的特征和菌落的溶血狀況先判斷出細(xì)菌屬于哪種大類，然后再進(jìn)一步培養(yǎng)觀察。

2.2.2菌種保存

使用斜面保存法對分離的菌種進(jìn)行保存，針對葡萄球菌和腸道桿菌，直接接種在普通的瓊脂斜面上，然后把斜面的底部加一些無糖肉膏液，最后用橡皮塞塞好，經(jīng)過37℃恒溫箱培養(yǎng)24h～48h以后，放在4℃的冰箱里面進(jìn)行保存，這種保存方法可以將菌種保存3-6個月。針對鏈球菌應(yīng)當(dāng)接種在血液瓊脂斜面上，然后放在37℃的恒溫箱里面培養(yǎng)24h～48h以后，也放在4℃的冰箱里面進(jìn)行保存，不過需要注意的是半個月到1個月要移種一次。

2.3生化鑒定

2.3.1葡萄球菌生化鑒定

將在普通瓊脂培養(yǎng)基上長的比較好的，革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為G＋的，以單個或者是葡萄串形狀排列的細(xì)菌，使用葡萄球菌屬細(xì)菌生化鑒定管對菌種進(jìn)行鑒定，每盒10支裝，共有11種。鑒定的標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 不同種葡萄球菌的鑒定標(biāo)準(zhǔn)

2.3.2鏈球菌生化鑒定

將在血瓊脂培養(yǎng)基上長的比較好的，革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為G＋的，以短鏈狀排列或者是營養(yǎng)肉湯中以長鏈狀排列的細(xì)菌，使用鏈球菌細(xì)菌生化編碼鑒定管對菌種進(jìn)行鑒定，每盒10支，共12種。

2.3.3大腸桿菌生化鑒定

將在普通瓊脂培養(yǎng)基上長的比較好的，革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為G-的，以不大不小的短桿菌形狀排列的，使用腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管對菌種進(jìn)行鑒定，每盒10支，共11種。

2.4藥敏試驗

藥敏試驗采用紙片擴(kuò)散法，檢測可以分離得到細(xì)菌對藥敏紙片的敏感程度。

2.4.1菌液濃度的調(diào)節(jié)

挑取單個菌落接種到有關(guān)的營養(yǎng)肉湯中(鏈球菌中要加血清)，通過一定的稀釋來延長培養(yǎng)的時間調(diào)節(jié)濃度，將菌液濃度稀釋到一定的程度上，然后放在37℃的恒溫箱里面培養(yǎng)24h。

2.4.2細(xì)菌涂布接種和貼藥敏紙片

將培養(yǎng)后的葡萄球菌和大腸桿菌接種到普通的營養(yǎng)瓊脂平板上，鏈球菌接種到血瓊脂平板的表面上，然后用滅菌涂布棒把菌液均勻地涂在平板的表面，待表面稍干燥之后，用無菌攝子夾取有關(guān)的抗菌紙片，一定距離貼于平板之上，置室溫中恒溫培養(yǎng)一天。

2.4.3抑菌圈的測量與記錄

用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑和藥敏紙片的直徑，以1998年中國藥品生物檢定所和衛(wèi)生部制定的細(xì)菌耐藥性標(biāo)準(zhǔn)作為判定標(biāo)準(zhǔn)，直徑等于0的為不敏感，直徑小于20mm的是低度敏感，直徑在20mm至28mm之間的為中度敏感，直徑大于28mm的為高度敏感。

3 結(jié)果

3.1主要致病菌種類和比例

100份奶樣主要致病菌分離情況統(tǒng)計見表2。

表2 樣品中主要病原菌分離鑒定的結(jié)果

通過表2可以看出，在奶牛分泌的乳樣中，金黃色葡萄球菌74株，占細(xì)菌總數(shù)的69.16%；無乳鏈球菌27株，占25.23%；大腸桿菌6株，占細(xì)菌總數(shù)的5.61%。通過分析可以發(fā)現(xiàn)，在導(dǎo)致奶牛感染乳房炎的主要致病菌中，金黃色葡萄球菌的比例最高，其次是無乳鏈球菌，大腸桿菌最少。

3.2病原菌的感染情況

本次實驗檢測的奶樣中，病原菌單獨感染的概率為48.78%，其中金黃色葡萄球菌的單獨感染的概率高達(dá)39.02%;病原菌混合感染的概率高達(dá)51.22%，分離的大腸桿菌均是和金黃色葡萄球菌或無乳鏈球菌混合感染。

導(dǎo)致奶牛感染乳房炎的致病菌中，原因主要是單獨感染了金黃色葡萄球菌占細(xì)菌總數(shù)的39.02%，單獨感染了無乳鏈球菌占細(xì)菌總數(shù)的9.76，總之，48.78%的奶牛是因為單獨感染某一種致病菌導(dǎo)致發(fā)生乳房炎，51.22%的奶牛是因為混合感染了多種致病菌導(dǎo)致發(fā)生乳房炎。由此可以得出結(jié)論，一半以上的奶牛感染乳房炎主要是因為混和感染了多種致病菌。

3.3藥敏試驗結(jié)果

主要致病菌的藥敏試驗結(jié)果見表3。

表3 主要病原菌藥敏試驗結(jié)果(表中數(shù)據(jù)為抑菌圈直徑，單位mm)

通過表3可以看出，在本次藥敏試驗中，感染金黃色葡萄球菌的奶牛對青霉素不敏感，對林可霉素和環(huán)丙沙星高度敏感，對先鋒霉素V、阿米卡星、慶大霉素和氟呱酸為中度敏感，對菌必治、利福平、鏈霉素、羅紅霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素、痢特靈和四環(huán)素低度敏感。感染無乳鏈球菌的奶牛對青霉素也不敏感，對林可霉素和環(huán)丙沙星高度敏感，對先鋒霉素V、利福平、阿米卡星和慶大霉素中度敏感，對菌必治、鏈霉素、羅紅霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、氟呱酸、克林霉素、痢特靈和四環(huán)素低度敏感。感染大腸桿菌的奶牛對先鋒霉素V、慶大霉素和林可霉素高度敏感，對氟呱酸、四環(huán)素和環(huán)丙沙星中度敏感。對青霉素、菌必治、利福平、鏈霉素、阿米卡星、羅紅霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素和痢特靈為低度敏感藥物。

3.4討論

引起奶牛感染病原體的原因有很多，包括各種細(xì)菌和病毒，這種情況下，實現(xiàn)對病原微生物的研究就十分重要。通過試驗研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致奶牛感染乳房炎的主要的致病菌有葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌，其中葡萄球菌和鏈球菌占致病菌總數(shù)的94.39%，大腸桿菌只有5.61%。而且根據(jù)調(diào)查研究還可以發(fā)現(xiàn)：如果奶牛被其中一種細(xì)菌感染，其自身的免疫力及抵抗力會下降，就更容易被其他的病菌侵害。由此可見，奶牛極有可能是被其中一種病菌侵害，且發(fā)生混合感染的概率更高，高達(dá)51.22%。在對感染金黃色葡萄球菌而發(fā)生乳房炎的奶牛進(jìn)行用藥治療時，需要注意藥物的敏感性，尤其要注意林可霉素和環(huán)丙沙星的用藥，這兩種屬于高度敏感藥物；盡量不使用先鋒霉素V、阿米卡星、慶大霉素和氟呱酸等中度敏感藥物；謹(jǐn)慎使用菌必治、利福平、鏈霉素、羅紅霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素、痢特靈和四環(huán)素等低敏感度藥物。對感染無乳鏈球菌而發(fā)生乳房炎的奶牛進(jìn)行用藥治療時，尤其要注意林可霉素和環(huán)丙沙星這兩種高度敏感藥物；盡量不使用先鋒霉素V、利福平、阿米卡星和慶大霉素等中度敏感藥物；謹(jǐn)慎使用菌必治、鏈霉素、羅紅霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、氟呱酸、克林霉素、痢特靈和四環(huán)素等低度敏感藥物。在對感染大腸桿菌而發(fā)生乳房炎的奶牛進(jìn)行用藥治療時，尤其要注意先鋒霉素V、慶大霉素和林可霉素等高度敏感藥物的使用；盡量不使用氟呱酸、四環(huán)素和環(huán)丙沙星等中度敏感藥物；謹(jǐn)慎使用青霉素、菌必治、利福平、鏈霉素、阿米卡星、羅紅霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素和痢特靈等低度敏感藥物。

另外，本實驗還有一些不足之處 ，主要表現(xiàn)在通過試驗分析只分別得出了金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌的藥物敏感情況，沒有總結(jié)出奶?；旌细腥径喾N致病菌導(dǎo)致發(fā)生乳房炎以后，在臨床用藥時應(yīng)當(dāng)注意選擇哪些敏感藥物，此后還應(yīng)進(jìn)行混合感染后敏感藥物篩選方面的研究，對臨床用藥具有重要的指導(dǎo)意義。