星點設計-效應面法（CCD-RSM）優(yōu)選頸痛巴布劑提取工藝研究*

楊全偉，程 璐，馬浩然，張 耕，譚靜玲

（1.武漢市第一醫(yī)院，湖北 武漢430022；2.湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院中藥所，湖北 武漢430064）

頸痛巴布劑為武漢市中西醫(yī)結合醫(yī)院國家級重點?？漆樉目茝埣t星主任醫(yī)師的臨床處方，由《傷寒論》中葛根湯的基礎上加減化裁而成，該方對神經(jīng)根型頸椎病具有很好的療效，用于治療頸椎病，尤其是神經(jīng)根型頸椎病，主要癥見頸肩背強痛，頸部活動受限，常伴上肢放射性痛、麻木，甚則肌肉萎縮。本方為純中藥制劑，以前多與凡士林調和后涂敷與病患部位進行使用，經(jīng)多年臨床使用，副作用少、療效確切。本研究在原組方不變的基礎上，進行劑型改革，將傳統(tǒng)膏藥制劑制成具有良好的舒適性、滲透性好、使用方便，不污染衣物的巴布劑[1]。為了優(yōu)選其最佳提取工藝條件，以方中君藥葛根中有效成分葛根素的提取量和干膏提取率作為提取指標，采用HPLC 法測定處方中葛根素的含量，結合提取的干膏得率，以加水量、提取時間、提取次數(shù)分別設定其提取因素水平，以星點設計-效應面進行工藝，試驗方法與結果報道如下。

1 儀器與試藥

Waters e2695 高效液相色譜儀；賽多利斯ME215S 電子天平（Max210g d=0.01mg）；葛根素對照品（批號：110752-201110）；藥材（葛根、芍藥、防風、黃芪、桂枝、川芎、當歸、炙甘草等10 味中藥）（購于湖北天濟醫(yī)藥有限公司）；甲醇為色譜純，水為雙重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 試驗與結果

按處方比例稱取藥材137g，加水回流提取，收集所得藥液，濃縮，加苯甲酸鈉0.6g，調整全量至200mL，搖勻，裝入棕色瓶中，密閉陰涼處保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1 實驗儀器與材料[2]

色譜條件：色譜柱：依利特ODS HYPERSIC-C18柱（200mm×4.6mm，5μm），流動相：甲醇-水（20∶80），流速：1.0mL/min，波長：250nm，柱溫：25℃

2.2 溶液的制備

葛根素對照品溶液的制備：精密稱取葛根素13.99mg，置于100mL 容量瓶中，加30%乙醇，制成每1mL 含0.139 9mg 的溶液，作為對照品溶液。

供試品溶液的制備[3-4]：按處方比例稱取藥材137g，用8 倍量的水，回流提取2 次，每次提取1h，收集所得藥液，濃縮至一定程度，加苯甲酸鈉0.6g，調整全量至200mL，搖勻，作為實驗樣品；精密量取樣品1mL，置50mL 容量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得。

葛根陰性溶液的制備：稱取不含葛根的其余藥材，用8 倍量的水，浸泡0.5h，回流提取2 次，每次提取1h，收集所得藥液，濃縮至一定程度，加苯甲酸鈉0.6g，調整全量至200mL，搖勻，按葛根供試品溶液制法即得。

2.3 方法

2.3.1 方法專屬性

吸取對照品溶液、供試品、葛根陰性對照溶液各20μL，進樣，檢測，葛根素對照品、供試品、在18min 左右出現(xiàn)葛根素色譜峰，葛根陰性對照無干擾，見圖1-3。

圖1 對照品

圖2 供試品

圖3 陰性對照

表1 根痛合劑加樣回收率試驗結果

2.3.2 線性關系試驗

取上述葛根素對照品溶液，分別在上述色譜條件下，分別進樣2，4，8，12，16，20μL 注入高效液相色譜色譜中，測定峰面積，以峰面積、對照品濃度計算線性回歸方程：Y=11143X-23229，r=0.9999；表明葛根素在0.2798～2.798μg 范圍內線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗

取上述對照品溶液，精密取10mL 至20mL 量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得，進樣20μL，連續(xù)進樣6 次，記錄葛根素峰面積RSD=1.02%，表明儀器的精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取2.2 項下的溶液的制備項下供試品溶液中制備的實驗樣品，搖勻，精密量取1mL，置50mL 容量瓶中，加30%乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得。分別于0，1，4，8，12，24h 進樣20μL，測定峰面積，計算葛根素峰面積RSD=0.49%，表明供試品溶液在24h 內穩(wěn)定。

2.3.5 重現(xiàn)性試驗

取同一批2.2 項下的溶液的制備項下供試品溶液中制備的實驗樣品，按供試品溶液的制備方法平行制備6 份，測定葛根素的含量，計算結果平均含量為4.722mg·mL-1，RSD 值為0.83%，表明本法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗

取已知含量樣品1 份，搖勻，分別6 次精密量取1mL，置于6 個100mL 容量瓶中，各精密加入適量的葛根素對照品，加30%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液即得，分別進樣20μL，測定并計算回收率，平均回收率為100.89%（RSD=0.96%），結果見下表1。

3 星點設計-效應面實驗結果

在查閱文獻基礎上[5-8]，針對加水量，提取時間、提取次數(shù)3 個影響因素，分別設置3 個水平，以葛根素含量和干膏得率作為考察指標，采用星點設計-效應面進行工藝優(yōu)選，結果見表2，表3。

3.1 模型擬合

根據(jù)實驗結果，采用按照Design-Expert.V8.0.6.1 分別以葛根素含量為Y1，干膏得率Y2，對所選的2 個因素分別進行多元線性回歸方程及二次多項式擬合，分別得回歸方程為Y1=661.12+2.95X1-4.14X2+142.02X3（r=0.568 1，P=0.022 2）；Y2=30.60-1.21X1+0.55X2+3.39X3（r=0.786 5，P=0.000 5）。二項多項式方程為：Y1=807.49+2.95X1-4.14X2+142.02X3 -84.75X1X2 -25.01X1X3 +21.51X2X3 -106.59X12-80.04X22-87.80X32（r=0.972 1，P=0.002 3）；Y2 =31.39 -1.21X1 +0.55X2 +3.39X3 -1.28X1X2 +1.01X1X3-0.13X2X3+0.21X12-0.66X22-1.03X32（r=0.906 6，P=0.039 1）。

表2 星點設計因素水平

表3 星點設計及各指標試驗結果

根據(jù)多元線性方程及二次多項式方程數(shù)據(jù)可以看出，各自的回歸方程數(shù)據(jù)顯示二項式方程的r值更接近1，P 值小于0.05. 故選擇二項式模型為最終效應模型。

3.2 效應面優(yōu)化與評估

根據(jù)模型擬合得到的二項式方程，采用Design-Expert.V8.0.6.1 軟件分別繪制各指標與因素的三維效應圖和二維等高圖，由圖1 可知，葛根素含量（Y1）和干膏得率（Y2）隨加水量、提取時間的增加而增加，然后到達頂點后再減少；隨提取次數(shù)的增加而增加。葛根素的含量（Y1）由軟件計算得最佳提取條件為加水量8.78 倍，提取3 次，每次提取1.87h；干膏得率（Y2）的最佳提取條件為加水量8.66 倍，提取3 次，每次提取1.82h；綜合考慮，最終優(yōu)選頸痛巴布劑處方最佳提取條件為加水8.7 倍，提取3 次，每次提取1.85h。見圖4.

圖4 葛根素含量（Y1）、干膏得率（Y2）對X2、X3 的三維效應圖（A、C）和二維等高圖（B、D）

4 優(yōu)化驗證

按照優(yōu)選出的頸痛巴布劑處方的最佳提取條件，平行操作3 次，取其平均值與預測值進行比較，結果可知，實驗值與預測值可以較好的描述其最佳提取關系，3 批驗證結果葛根素含量及干膏得率較高，測定葛根藥材的含量為47.296mg/g，計算3 批驗證結果的平均轉移率為56.64%，轉移率較高，可以繼續(xù)下一步的中試生產(chǎn)研究。驗證結果見表4.

表4 驗證結果

5 討論

星點設計-效應面法可以彌補均勻設計和正交設計在實驗中水平選擇上的精確度，避免各因素之間的交互作用，可以優(yōu)選出實驗中的最佳提取工藝條件范圍，以便在實驗中來更加明確，細化，留有實際操作空間，以彌補均勻設計和正交設計的大線條和條件篩選狹窄的缺點[9-12]。同時通過星點設計-效應面可以預測出最佳工藝的指標值，以便按其實驗條件可以得出實際結果進行比對，通過相對標準偏差來檢驗實驗的準確性。優(yōu)選的各項指標范圍的變化較小，方法穩(wěn)定可靠，可以更好的適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

雖然星點設計-效應面優(yōu)勢明顯，但是如果所選擇的實驗因素較多，水平較多，會使得實驗數(shù)成倍的增加，實驗勞動過程強度會很大[13-14]。故本實驗中，通過查閱文獻，選擇了對處方提取最關鍵的提取因素，設計了最可能影響實驗的因素水平，以便能用較少的實驗來優(yōu)選出最佳提取工藝條件。

有報道[15]，有采用CCD-RSM 法對葛根藥材進行了提取工藝研究，選擇因素僅考慮了加水量和提取時間，忽略了實驗次數(shù)因素，本實驗中，實驗次數(shù)對葛根素含量和干膏得率影響較大，故加入了試驗次數(shù)這個因素進行了工藝優(yōu)選，使得本實驗更加全面。為實驗參數(shù)的選擇提供了較完整的科學依據(jù)。

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