清熱解毒化濁片對腸源性內(nèi)毒素血癥大鼠肝肺促炎因子IL-8及抗炎因子IL-10 的影響*

毛婭男，趙國榮，連俊凱，陳研焰，李雄安，何宜榮，艾碧琛

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙410208）

正常情況下，機體腸道內(nèi)存在由大量G-細菌釋放的內(nèi)毒素（LPS），由于腸道粘膜的屏障作用，肝巨噬細胞（KC）的清除作用，LPS 很難進入體循環(huán)，當(dāng)腸粘膜完整性破壞，KC 吞噬能力障礙時，大量LPS 入血，形成內(nèi)毒素血癥，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，因LPS 來自于腸道，故稱為腸源性內(nèi)毒素血癥（IETM）。IETM 形成后可激活KC 大量釋放炎性因子，造成肝、肺炎性損傷[1]，IETM 是急性肝衰竭、急性肺損傷、肝肺綜合征、全身炎癥反應(yīng)綜合征發(fā)生的重要原因。臨床對于IETM 的治療重點在于改善并發(fā)癥，控制病情，尚無針對IETM 療效確切的藥物。清熱解毒化濁片為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，具有減輕炎癥反應(yīng)，保肝護肝作用[2]。前期研究表明清熱解毒化濁片可降低血漿內(nèi)毒素水平，終止肝損傷的惡性循環(huán)，達到減輕肝臟炎性反應(yīng)的目的[3]。本研究擬建立IETM 肝肺損傷大鼠模型，進一步探討清熱解毒化濁片對肝肺的保護作用。

1 材料

1.1 動物

清潔級雄性SD 大鼠70 只，體質(zhì)量為（200±10）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。許可證號：SYXK（湘）2013-0005，合格證號：43004700007002。

1.2 藥物與飼料

清熱解毒化濁片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供（批號：20140605），52°紅星二鍋頭由北京紅星股份有限公司提供（批號：20140128），大鼠普通飼料及高脂高糖飼料由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供。高脂高糖飼料綜合文獻[4]配制方法上進行改進，其組成為：77.3%基礎(chǔ)飼料+0.2%丙基硫氧嘧啶+2%膽固醇+10%豬油+0.5%膽鹽+8%蛋黃粉+2%白糖。

1.3 試劑與儀器

鱟試劑盒由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病檢測室提供，生化檢測試劑盒由湖南中醫(yī)藥大學(xué)生化檢測中心提供，IL-8、IL-10 兔抗鼠抗體均由武漢博士德生物工程有限公司提供，通用型PV-9000試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。羅氏全自動生化分析儀（羅氏公司生產(chǎn)），RT-6000 酶標儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司），Motic B5顯微成像系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團公司），電熱恒溫箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司），電熱恒溫干燥烤箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），石蠟切片機、攤片機（天津市久圣醫(yī)療電子儀器有限公司）。

2 方法

2.1 動物模型制備

綜合文獻[5-6]方法并加以改進，予高脂高糖飼料喂養(yǎng)大鼠，同時每天按10mL/kg 劑量予52°二鍋頭灌胃1 次，并每周稱大鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整白酒劑量。以血液生化指標及肝、肺組織病理切片判斷造模成功與否。

2.2 分組及給藥

取SD 大鼠70 只，隨機分為空白組（10 只）和造模組（60 只）。造模組大鼠按2.1 方法進行造模。模型成功后，將造模組大鼠隨機分為模型組（10只）、清熱解毒化濁片組（10 只），清熱解毒化濁片組按0.081g/mL 灌胃，模型組及正常組予等容積蒸餾水灌胃，每組動物灌胃量均為1mL/100g·d-1，連續(xù)給藥4 周。

2.3 取材及指標檢測

末次給藥結(jié)束后，禁食不禁水12h，次日清晨，腹主動脈采血，3 000r/min，離心10min，取血清，采用羅氏分析儀分別檢測血清ALT、AST、GGT、ALP的含量，動態(tài)濁度法檢測血漿LPS 含量。同時，迅速摘取肝、肺臟，在肝、肺臟最大葉，距邊緣5mm 處取小塊肝、肺組織，部分用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察肝、肺組織病理學(xué)改變，部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，利用免疫組化PV 二步法檢測肝、肺組織中IL-8、IL-10 含量，采用光學(xué)顯微鏡和全自動圖像獲取系統(tǒng)Olympus DP71 在高倍鏡視野（×400）下隨機選取5 個區(qū)域，測量并記錄每個視野陽性染色的平均灰度值，作為該片的代表值，再計算該組的平均灰度，進行統(tǒng)計學(xué)比較。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件處理。計量資料數(shù)據(jù)按均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肝、肺組織病理學(xué)改變

正常組大鼠肝小葉輪廓清晰，肝細胞以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列。模型組可見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，呈點、片狀壞死，肝細胞水腫明顯，胞質(zhì)中可見大小不等、數(shù)量不一的圓形脂肪空泡，小葉中央靜脈周圍和匯管區(qū)有炎性細胞浸潤。清熱解毒化濁片組肝細胞輕微腫脹，結(jié)構(gòu)較疏松，部分肝細胞內(nèi)線粒體疏松，結(jié)構(gòu)欠清晰。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)觀察（HE 染色×400）

正常組大鼠肺泡隔間距小，肺泡形態(tài)完整未見明顯炎細胞浸潤。模型組肺泡隔間距明顯增寬，肺泡形態(tài)擠壓，明顯炎細胞浸潤，有間質(zhì)水腫可能。清熱解毒化濁片組肺泡隔間距較正常組的增寬，肺泡形態(tài)完整可見少量炎細胞浸潤。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)觀察（HE 染色×400）

3.2 清熱解毒化濁片對大鼠血清ALT、AST、GGT、ALP，血漿LPS 的影響

與正常組比較，模型組具有顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05），提示造模成功。經(jīng)治療后，與模型組比較，清熱解毒化濁片組血清ALT、AST、GGT、ALP均明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。結(jié)果見下頁表1。

3.3 清熱解毒化濁片對大鼠肝、肺組織IL-8、IL-10的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝、肺組織IL-8 表達存在顯著性差異（P＜0.01）。經(jīng)治療后，與模型組比較，清熱解毒化濁片組肝、肺組織IL-8 表達明顯降低（P＜0.01），IL-10 表達升高（P＜0.05）。結(jié)果見下頁表2、圖3-4、圖5-6。

表1 各組大鼠ALT、AST、GGT、ALP、LPS 的比較（x±s，n=10）

表2 各組大鼠肝、肺組織IL-8、IL-10 表達的比較（x±s，n=10）

圖3 各組大鼠肝組織IL-8 陽性表達觀察（免疫組化×400）

圖4 各組大鼠肺組織IL-8 陽性表達觀察（免疫組化×400）

4 討論

中醫(yī)尚無相應(yīng)病名的論述與記載，據(jù)研究G-細菌所引起的疾病類似濕熱病證的特點，而濕熱病患者血漿內(nèi)毒水平升高[7]，可見IETM 的中醫(yī)病因病機與濕熱濁毒有關(guān)。過食肥甘、嗜酒貪杯，致脾失健運，濕濁內(nèi)生，濕久釀熱，熱久蘊毒，濕熱濁毒膠著，熱蒸濕動，彌漫臟腑經(jīng)絡(luò)，出現(xiàn)各臟腑的濕熱癥狀。因此，中醫(yī)治療IETM 重點在于清熱解毒，祛濕化濁。清熱解毒化濁片由茵陳、滑石、木通、豆蔻仁、藿香、澤瀉、黃芩、薄荷、連翹等組成，其中茵陳、木通、澤瀉、滑石利濕化濁，導(dǎo)濕熱從小便而出；藿香、豆蔻芳香化濕，導(dǎo)濕從表而解；黃芩、連翹、薄荷清熱解毒，透熱外達。全方分消上下，透達內(nèi)外，共奏清熱解毒、利濕化濁之效。臨床發(fā)現(xiàn)，清熱解毒化濁片對于濕熱內(nèi)蘊證患者有良好的治療作用[8]。本實驗通過高脂高糖、酒精等復(fù)合因素建立IETM 肝、肺損傷大鼠模型，經(jīng)清熱解毒化濁片治療后，肝、肺損傷減輕，提示IETM 的形成與中醫(yī)濕熱濁毒密切相關(guān)。

圖5 各組大鼠肝組織IL-10 陽性表達觀察（免疫組化×400）

圖6 各組大鼠肺組織IL-10 陽性表達觀察（免疫組化×400）

多項研究認為IETM 是肝、肺損傷，肝肺綜合征形成的病理基礎(chǔ)。IETM 引發(fā)肝臟“二次打擊”，從而激活KC 釋放炎性介質(zhì)如TNF-α、IL-1、IL-8 等，一方面炎性因子隨血流入肺臟，導(dǎo)致肺臟炎性損傷；另一方面由于肝的解毒能力下降，被激活的肺內(nèi)巨噬細胞代償性清除LPS，同時分泌大量活性物質(zhì)如NO、CO、TNF-α、IL-1、IL-8 及其他的炎性介質(zhì)，加重肺臟損傷[9-10]。據(jù)文獻報道，降低LPS 水平，可直接拮抗IETM 效應(yīng)，達到減輕肝、肺炎性損傷的目的[11]，而前期研究發(fā)現(xiàn)清熱解毒化濁片有降低患者血漿內(nèi)毒素水平的作用。本研究通過復(fù)合因素建立IETM致肝、肺損傷大鼠模型，血漿LPS 水平升高（P＜0.05），血清ALT、AST、GGT、ALP 明顯升高（P＜0.01，P＜0.05），肝、肺組織出現(xiàn)炎性浸潤、結(jié)構(gòu)破壞等病理學(xué)改變，提示造模成功。經(jīng)清熱解毒化濁片治療后血漿LPS 明顯降低（P＜0.01），血清ALT、AST、GGT、ALP 均明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），肝、肺組織炎性細胞浸潤減輕，結(jié)構(gòu)較前清晰，與文獻報道一致，提示清熱解毒化濁片可減輕因IETM 所致的肝、肺炎性損傷，其作用機制與降低血中LPS 水平有關(guān)。

IL-8 是一種促炎癥因子，能特異性地促進中性粒細胞的趨化、變形、脫顆粒、釋放溶酶體酶等參與炎癥反應(yīng)，與多種炎性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。當(dāng)IETM 形成后LPS 即與KC 中TLR-4 受體結(jié)合導(dǎo)致TLR-4 寡聚化而被激活，通過MyD88 依賴和非MyD88 依賴的兩條途徑觸發(fā)一系列的信號級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)NF-KB、AP-1 和IRF-3 等轉(zhuǎn)錄因子磷酸化和核轉(zhuǎn)位，上調(diào)IL-8 的表達，大量IL-8 釋放入血，參與全身炎癥反應(yīng)[13]。研究認為，降低IL-8 的表達可減輕肝、肺組織的炎性損傷[14-15]。本實驗，IETM致肝、肺損傷大鼠模型中，肝、肺組織炎性浸潤，IL-8 表達水平明顯升高（P＜0.01），經(jīng)清熱解毒化濁片治療后肝、肺組織IL-8 明顯降低（P＜0.01），炎性損傷減輕，與文獻報道一致，提示清熱解毒化濁片具有降低IL-8 水平，從而改善組織炎性損傷的作用。IL-10 是重要的抗炎因子，既能下調(diào)T 淋巴細胞活性，抑制炎性細胞的激活、遷移和粘附，又可通過介導(dǎo)IKK-b/NF-κB 通路在轉(zhuǎn)錄水平上抑制炎性因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 等表達，改善炎癥反應(yīng)[16]。本實驗清熱解毒化濁片組大鼠肝、肺組織均出現(xiàn)IL-10 表達較其他組明顯升高（P＜0.01），提示清熱解毒化濁片可升高IL-10 的水平，達到抗炎作用。

綜上所述，清熱解毒化濁片具有清熱解毒、利濕化濁的功效，可治療因IETM 所致的濁毒蘊結(jié)，其作用機制與降低血漿LPS 水平，促進抑炎因子IL-10 的表達，降低促炎因子IL-8 的釋放，減輕肝、肺組織炎性損傷有關(guān)。

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