兩種α -葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)及轉(zhuǎn)苷作用

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國家工程實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)酶國家工程實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

來源于黑曲霉（Aspergillus niger）的不同α-葡萄糖苷酶，其對底物的水解和轉(zhuǎn)苷活性均存在一定差異，影響了它們在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用.以甲醇畢赤酵母重組菌株分別表達(dá)的兩種 α-葡萄糖苷酶 Glu-A和 Glu-B為研究對象，分析了兩種酶的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明Glu-A和Glu-B最適作用溫度均為50，℃，最適pH分別為5和6.對底物麥芽糖的轉(zhuǎn)苷作用研究表明，產(chǎn)物低聚異麥芽糖中各種糖的種類和比例差別較大，Glu-A作用麥芽糖后的總低聚糖、異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖的生成率分別為 51.04%、15.79%、31.41%和 4.18%，而 Glu-B作用麥芽糖后的總低聚糖、異麥芽糖、潘糖和異麥芽三糖的生成率分別為 35.85%、16.71%、4.15%與15.85%.

α-葡萄糖苷酶；低聚異麥芽糖；酶學(xué)性質(zhì)；轉(zhuǎn)苷作用

低聚異麥芽糖包括異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖等，α-葡萄糖苷酶（α-transglucosidase，E.C.2.4.1.24）可轉(zhuǎn)移葡萄糖基到麥芽糖、葡萄糖等底物分子上進(jìn)而獲得低聚異麥芽糖.研究［1］發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)α-葡萄糖苷酶較高的微生物主要是黑曲霉（Aspergillus niger），目前的研究主要集中在酶基因的克隆及高效表達(dá)［2-4］方面，而針對不同基因編碼的酶的性質(zhì)比較及轉(zhuǎn)苷應(yīng)用分析報(bào)道較少.α-葡萄糖苷酶同時(shí)具有水解和轉(zhuǎn)苷兩種活性，不同的α-葡萄糖苷酶所表現(xiàn)出的這兩種活性具有較大的差異.在低聚異麥芽糖生產(chǎn)中，針對不同生產(chǎn)目的，如對低聚異麥芽糖產(chǎn)品不同成分、不同濃度、不同純度等的要求，需要選擇具有不同轉(zhuǎn)苷活性或水解活性的酶.GenBank中已報(bào)道的編碼α-葡萄糖苷酶基因有7個(gè)，這7個(gè)基因之間DNA相似性程度較低，不到 40%，氨基酸序列相似性也只有 25%左右，為了分析這些不同的α-葡萄糖苷酶的功能和應(yīng)用特性，本文選取其中DNA和氨基酸序列相似度較高（均在50%左右）的兩個(gè)α-葡萄糖苷酶A（Glu-A）和α-葡萄糖苷酶 B（Glu-B）為研究對象，首先實(shí)現(xiàn)了這兩個(gè)酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)，并主要對這兩個(gè)酶的酶學(xué)性質(zhì)及轉(zhuǎn)苷作用進(jìn)行比較分析，為研究其他幾種酶的酶學(xué)性質(zhì)和酶的功能與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，也可為α-葡萄糖苷酶在低聚異麥芽糖生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 菌株

畢赤酵母工程菌P. ，pastoris A、P.， pastoris B，由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2 培養(yǎng)基

YPG固體培養(yǎng)基：酵母粉5，g、蛋白胨10，g、甘油10，g、瓊脂 5，g，溶解于 500，mL水中.121，℃滅菌20，min.

BMGY培養(yǎng)基：酵母粉5，g、蛋白胨12，g，溶解于420，mL水中.121，℃滅菌 20，min.冷卻至室溫加入60，mL 1，mol/L的磷酸鉀緩沖液、60，mL酵母氮源、1.2，mL生物素溶解液、60，mL甘油溶解液.

BMMY培養(yǎng)基：酵母粉 6，g、蛋白胨 12，g，溶解于420，mL水中.121，℃滅菌20，min.冷卻至室溫加入 60，mL 1，mol/L的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液、60，mL酵母氮源、1.2，mL生物素溶解液、60，mL甲醇溶解液.

1.3 酶活的測定方法

采用QB 2525—2001《食品添加劑·α-葡萄糖轉(zhuǎn)苷酶》的方法進(jìn)行酶活的測定：用α-葡萄糖苷酶作用底物α-甲基-D-葡萄糖苷生成葡萄糖，所生成的葡萄糖與含有葡萄糖氧化酶、過氧化物酶的 4-氨基安替比林和酚試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)來定量測定.在此實(shí)驗(yàn)條件下，在 2.5，mL上述混合物的反應(yīng)體系中，60，min產(chǎn)生l μg葡萄糖所需的酶量定義為一個(gè)α-葡萄糖苷酶活力單位.

1.4 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.4.1 酶的最適反應(yīng)溫度及穩(wěn)定性

將兩種畢赤酵母工程菌產(chǎn)α-葡萄糖苷酶酶液取2，mL分別置于10～90，℃的條件下取樣測定酶活，以最高酶活為相對酶活100%.在pH 5.0條件下，將酶液在不同的溫度下保溫 0.5，h，將不進(jìn)行溫度處理的酶液作為相對酶活100%.

1.4.2 酶的最適反應(yīng)pH及穩(wěn)定性

在 4，℃反應(yīng)條件下，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液配制 pH分別為2、3、4、5、6、7、8、9，質(zhì)量濃度為 20，g/L的α-甲基-D-葡萄糖苷底物溶液.測定兩種酶的酶活力.以最高酶活計(jì)為 100%.在室溫條件下，將酶液分別置于不同 pH條件下，保溫 0.5，h，測定酶活力，將未進(jìn)行處理的酶液計(jì)為100%.

1.5 轉(zhuǎn)苷實(shí)驗(yàn)及產(chǎn)物成分分析

用pH為5的緩沖液配制質(zhì)量濃度為200，g/L的麥芽糖溶液50，mL裝入250，mL三角瓶中.α-葡萄糖苷酶加酶量為 36，U/mL，封住瓶口，將三角瓶置于55，℃水浴搖床進(jìn)行轉(zhuǎn)苷反應(yīng) 30，h.取樣測定各種低聚糖的含量，分析轉(zhuǎn)苷結(jié)果.

轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物成分分析采用高效液相色譜法.色譜條件：Prevail Carbohydrate色譜柱（250，mm× 4.6，mm），流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù) 75%乙腈水溶液，柱溫30，℃，流量 1，mL/min，進(jìn)樣量 10，μL，蒸發(fā)溫度90，℃，蒸發(fā)氣體流量2.0，L/min.

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種α-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)

2.1.1 最適溫度及溫度穩(wěn)定性

溫度對兩種α-葡萄糖苷酶的酶活力影響結(jié)果如圖1所示.由圖1可知：兩種α-葡萄糖苷酶的最適反應(yīng)溫度均為50，℃.在溫度大于30，℃時(shí)，酶活力迅速上升，在 40～60，℃酶活保持較為穩(wěn)定狀態(tài).當(dāng)溫度超過 60，℃時(shí)，兩種酶的酶活均迅速下降.α-葡萄糖苷酶 Glu-A在 80，℃時(shí)就已經(jīng)失活，而 Glu-B在80，℃時(shí)的酶活也很低，在 90，℃時(shí)完全失活.將兩種酶液在不同的溫度條件下保溫 0.5，h后，測定酶活力結(jié)果如圖2所示.在10～60，℃時(shí)兩種酶酶活力保持相對穩(wěn)定狀態(tài)，Glu-A穩(wěn)定性高于 Glu-B.在溫度高于60，℃時(shí)，酶活力迅速下降.

圖1 溫度-酶活力曲線Fig. 1 Temperature-enzyme activity curve

圖2 溫度-酶活力穩(wěn)定性曲線Fig. 2 Temperature-enzyme stability curve

2.1.2 最適pH及pH穩(wěn)定性

pH-酶活力曲線如圖 3所示.pH-酶活力穩(wěn)定性曲線如圖4所示.

圖3 pH-酶活力曲線Fig. 3 pH-enzyme activity curve

圖4 pH-酶活力穩(wěn)定性曲線Fig. 4 pH-enzyme stability curve

由圖 3可知：α-葡萄糖苷酶 Glu-A的酶活最適pH為 5，α-葡萄糖苷酶 Glu-B的酶活最適 pH為6.由圖4可知：Glu-A的pH穩(wěn)定范圍為5～6，穩(wěn)定范圍較窄，當(dāng)pH低于5或高于6時(shí)，酶活力迅速下降.Glu-B的pH穩(wěn)定性范圍較寬，在pH 5～7之間均能保持一定的酶活力.

2.2 轉(zhuǎn)苷作用及產(chǎn)物分析

利用麥芽糖作為底物，配制質(zhì)量濃度為 200，g/L的麥芽糖溶液，加入α-葡萄糖苷酶進(jìn)行轉(zhuǎn)苷反應(yīng).反應(yīng)結(jié)果用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行分析［5］，兩種α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷麥芽糖結(jié)果如圖 5、圖 6所示，生成率數(shù)值見表1.

圖5 Glu-A轉(zhuǎn)苷作用產(chǎn)物液相分析圖譜Fig. 5 HPLC of Glu-A transferred maltose

圖6 Glu-B轉(zhuǎn)苷作用產(chǎn)物液相分析圖譜Fig. 6 HPLC of Glu-B transferred maltose

通過圖5、圖6及表1可以發(fā)現(xiàn)，不同目的基因來源于黑曲霉的兩種畢赤酵母工程菌所產(chǎn)α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷麥芽糖的結(jié)果不同.Glu-A轉(zhuǎn)化麥芽糖生成潘糖的效率最高，潘糖的生成率達(dá)到了 31.41%，其次為異麥芽糖的生成率為 15.79%，最低為異麥芽三糖，生成率為 4.18%.Glu-B轉(zhuǎn)化麥芽糖生成的產(chǎn)物中異麥芽糖及異麥芽三糖的生成率較高，分別為 16.71%、15.85%，潘糖最低，為4.15%.這一結(jié)果可能是由于這兩種不同的α-葡萄糖苷酶基因序列的差異，以及氨基酸組成的不同而導(dǎo)致轉(zhuǎn)苷過程中對葡萄糖苷元的偏好不同，出現(xiàn)了不同的轉(zhuǎn)苷結(jié)果［6］.

表1 兩種α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷作用結(jié)果Tab. 1 Results of two α-transglucosidase transferred maltose

3 討 論

通過對本實(shí)驗(yàn)室保存的畢赤酵母重組菌株P(guān).，pastoris A和P.，pastoris B所表達(dá)的α-葡萄糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，兩種酶的酶學(xué)性質(zhì)基本相同.Glu-A和 Glu-B的最適溫度均為 50，℃，10～60，℃時(shí)酶活力均保持相對穩(wěn)定狀態(tài).最適溫度比報(bào)道中黑曲霉所產(chǎn)的α-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度55，℃略低［7］.兩種酶的最適pH分別為5、6；pH穩(wěn)定性范圍分別為 5～6和 5～7，pH穩(wěn)定范圍具有一定的差異性，Glu-B pH穩(wěn)定范圍較Glu-A的pH穩(wěn)定范圍寬.日本田野制藥株式會(huì)社所生產(chǎn)的α-葡萄糖苷酶最適反應(yīng)溫度為 65，℃，最適 pH為 5.0［8］.在轉(zhuǎn)苷作用方面，不同基因編碼的α-葡萄糖苷酶具有不同的轉(zhuǎn)苷效果，Glu-A和 Glu-B轉(zhuǎn)苷麥芽糖后，總低聚異麥芽糖生成率分別為51.04%和35.85%，Chen等［9］從黑曲霉中獲得α-葡萄糖苷酶基因構(gòu)建載體并在畢赤酵母工程菌中表達(dá)，所得酶以異麥芽糖為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)，總低聚異麥芽糖生成率為 26%.本文中的Glu-A偏向于將α-1，4糖苷鍵打開，使游離出的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到麥芽糖上形成α-1，6糖苷鍵，因而麥芽糖轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物中潘糖的量高.而 Glu-B則偏向于將α-1，4糖苷鍵打開，使游離出的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到葡萄糖和異麥芽糖上形成α-1，6糖苷鍵，最終轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物中異麥芽糖及異麥芽三糖的量較高.本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Glu-A和 Glu-B雖然都來源于黑曲霉，但α-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)及轉(zhuǎn)苷作用存在著一定的差異性，這將為利用不同α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)苷作用生產(chǎn)低聚異麥芽糖的研究提供依據(jù)和參考.

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兩種α -葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)及轉(zhuǎn)苷作用

王舒雅，胡頓吉，劉逸寒，李 玉

Enzymatic Properties and the Transglycosidation of Two α-glucosidase

WANG Shuya，HU Dunji，LIU Yihan，LI Yu
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

The hydrolytic and transglycosidational activities vary for different α-transglucisidases derived from Aspergillus niger. These differences can affect their practical applications. Two α-transglucosidases， Glu-A and Glu-B，were expressed in Pichia pastoris to investigate their enzymatic properties. Results showed that the optimum temperature for both αtransglucisidases Glu-A and Glu-B was 55，℃，with an optimum pH at 5 and 6，respectively. Studies of Glu-A and Glu-Bwith maltose as the substrate revealed significant differences in their transglycosidational activities in terms of the compositionof their products，with Glu-A producing 51.04% oligosaccharide，15.79% isomaltose，31.41% panose，and 4.18% isomaltotriose versus corresponding products of 35.85%，16.71%，4.15%，and 15.85% generated by Glu-B.

α-glucosidase；isomaltose；enzymatic properties；transglycosidation

Q814.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-6510（2015）02-0021-04

10.13364/j.issn.1672-6510.20140071

2014-05-07；

2014-07-16

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）資助項(xiàng)目（2013AA102106-07）；教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”項(xiàng)目（IRT1166）

王舒雅（1987—），女，山東煙臺(tái)人，碩士研究生；通信作者：李 玉，教授，liyu@tust.edu.cn.

周建軍