陳皮石油醚相中抗蘋果腐爛病菌活性物質(zhì)研究

張相飛 杜春華 郝雙紅 李凌緒

摘要：陳皮石油醚提取物中富含對蘋果腐爛病菌（Valsa mali）具有抑菌活性的物質(zhì)，研究通過反復(fù)硅膠柱層析、制備高效液相色譜、重結(jié)晶對餾分F15純化獲得了3個(gè)活性單體A、B、C。核磁共振數(shù)據(jù)顯示A、B、C分別為3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素和川陳皮素。采用生長速率法測定A、B、C的抑菌活性，結(jié)果表明，3個(gè)化合物對蘋果腐爛病菌的EC50分別為68.19、1.56、24.02 μg/mL，其中橘皮素對蘋果腐爛病菌的抑菌活性最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：陳皮；蘋果腐爛病菌（Valsa mali）；多甲氧基黃酮；分離純化；抑菌活性

中圖分類號：S432.9+8；S482.2+92 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）13-3150-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.13.020

Research of Active Material in Petroleum Ether Extraction from Tangerine Peel

for in Vitro Control of Valsa mali

ZHANG Xiang-feia，DU Chun-huaa，HAO Shuang-honga，LI Ling-xub

（a.College of Chemistry and Pharmaceutical Science； b.College of Agronomy and Plant Protection， Qingdao Agricultural University，

Qingdao 266109， Shandong，China）

Abstract： Petroleum ether extraction from tangerine peel was rich in active ingredients against Valsa mali. Research through purification obtained three active monomers A，B，C by repeated silica gel column chromatography，the preparation of high performance liquid chromatography and recrystallization on fraction F15. Monomeric compounds A，B and C were determined as 3，5，6，7，8，3′，4′-heptamethoxyflavone， tangeretin and nobiletin，respectively. Growth rate method was used to determine the bacteriostatic activity of A，B，C. The results showed that all the three monomeric compounds were strong inhibitors against Valsa mali and the EC50 were 68.19，1.56 and 24.02 μg/mL respctively. Among them tangeretin had strongest antifungal activity against Valsa mali.

Key words： tangerine peel； Valsa mali； polymethoxyflavones； separation； antifungal activity

蘋果樹腐爛病是一種由蘋果腐爛病菌（Valsa mali）引起的毀滅性的病害，主要為害主枝主干，在中國蘋果主產(chǎn)區(qū)的總體發(fā)生率為52.7%，造成巨額損失[1]?；瘜W(xué)防治是目前生產(chǎn)上防治蘋果樹腐爛病的主要手段，但現(xiàn)有的化學(xué)農(nóng)藥很難有效控制蘋果樹腐爛病的發(fā)生與危害，亟需開發(fā)新型的農(nóng)藥。天然產(chǎn)物因其活性高、結(jié)構(gòu)新穎被視為新型農(nóng)藥先導(dǎo)化合物的重要來源。陳皮為蕓香科植物橘（Citrus reticulate Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮，含有揮發(fā)油、黃酮、生物堿、肌醇等活性成分，具有理氣健脾、燥濕化痰的功能[2，3]。同時(shí)陳皮中也富含具有抑制霉菌作用的活性物質(zhì)[4-7]，本課題組的前期研究表明陳皮脂溶性成分具有強(qiáng)烈的抑制蘋果腐爛病菌生長的活性[8，9]。本研究擬在活性追蹤的指導(dǎo)下對陳皮提取物的石油醚相進(jìn)行分離純化，明確其中對蘋果腐爛病菌具有抑菌活性的化學(xué)成分，為開發(fā)防治蘋果樹腐爛病的新型農(nóng)藥提供先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 供試材料

陳皮于2011年7月購自青島市城陽區(qū)富康大藥房，產(chǎn)地為浙江黃巖。陳皮在室內(nèi)陰干，磨粉備用。

1.2 供試菌種

供試植物病原菌為蘋果腐爛病菌，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院提供。

1.3 儀器設(shè)備

核磁共振儀為Bruker AV-500型。高效液相色譜儀為天津科器高新技術(shù)公司YZS-3型（ODS C18柱，40 mm×300 mm，10～30 μm）。柱色譜用100～200目硅膠及薄層色譜硅膠H均購自青島海洋化工公司。

1.4 化合物的提取、分離與純化

取陳皮粉末3 kg加入9 L的75%乙醇60 ℃提取3 h，過濾收集濾液。重復(fù)提取3次后合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀，得陳皮粗提物126.37 g。粗提物經(jīng)石油醚萃取，得石油醚相24.85 g。取石油醚相20 g經(jīng)硅膠柱層析分離，以石油醚∶乙酸乙酯梯度（100∶0→100∶1→20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1→1∶100）洗脫，經(jīng)TLC（薄層色譜法）分析后合并相同組分，共獲得15個(gè)餾分，編號為F01-F15。F15經(jīng)反復(fù)硅膠柱層析分離，用石油醚∶乙酸乙酯（3∶1）洗脫獲得F1501、F1502、F1503共3個(gè)組分。F1502經(jīng)中壓制備HPLC（高效液相色譜法）分離，流動相為乙腈，UV（紫外光）檢測器，波長255 nm，流速15 mL/min，獲得化合物A（保留時(shí)間26 min）32 mg和化合物B（保留時(shí)間21 min）21 mg。F1503經(jīng)丙酮重結(jié)晶獲得化合物C共81 mg。

1.5 抑菌活性測定方法

采用生長速率法測定15個(gè)餾分及單體化合物的抑菌活性，試驗(yàn)過程中所用培養(yǎng)基、玻璃制品等均經(jīng)滅菌。稱取適量餾分或單體化合物，用少量丙酮溶解，加入到已融化的60 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，搖勻，倒入直徑60 mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基冷卻凝固后移入生長一致、直徑為4 mm的蘋果腐爛病菌菌餅。以加入等量丙酮的培養(yǎng)基為對照，每處理重復(fù)3次。將培養(yǎng)皿置于27 ℃恒溫培養(yǎng)，至對照接近長滿菌時(shí)采用十字交叉法測量菌落直徑，抑菌率計(jì)算公式為：

抑菌率=（對照組菌落純生長量—處理組菌落純生長量）/對照組菌落純生長量×100%

使用SPSS20.0的Probit模型進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得出不同化合物的EC50和毒力方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同餾分對蘋果腐爛病菌的抑菌活性

陳皮乙醇提取物的石油醚萃取相經(jīng)硅膠柱層析后共獲得了15個(gè)餾分，采用生長速率法測定了不同餾分對蘋果腐爛病菌的抑菌作用，濃度為200 mg/mL時(shí)各餾分的抑菌作用如表1所示。由表1可知，石油醚相中的活性成分主要存在于高極性部分，其中餾分F15對蘋果腐爛病菌的抑菌率最高，為（96.73±1.36）%，抑菌活性最強(qiáng)，因此優(yōu)先對餾分F15進(jìn)行了分離純化。

2.2 化合物結(jié)構(gòu)表征

化合物A為無色至黃綠色針狀結(jié)晶（乙腈），熔點(diǎn)129～130 ℃。1H-NMR（CDCl3，500 MHz）δ：7.816（1H，s，H-2′），7.016（1H，s，J=8.5 Hz，H-5′），7.845（1H，d，J=8.5 Hz，H-6′），4.104（3H，s，OCH3），4.010（3H，s，OCH3），3.979（9H，s，3×OCH3），3.954（3H，s，OCH3），3.894（3H，s，OCH3）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：152.985（C-2），140.619（C-3），173.738（C-4），148.069（C-5），143.713（C-6），151.166（C-7），137.692（C-8），146.635（C-9），114.955（C-10），123.307（C-1′），110.839（C-2′，C-5′），150.910（C-3′），148.617（C-4′），121.792（C-6′），62.176、61.837、61.743、61.562、59.728（3-、5-、6-、7-、8-C），55.865、55.777（3′、4-C′）。其核磁共振氫譜、碳譜數(shù)據(jù)與3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮一致[10，11]。故推斷化合物A為3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮，分子式為C22H24O9，分子量為432。

化合物B為無色針狀結(jié)晶（乙腈），熔點(diǎn)50～51 ℃。1H-NMR（CDCl3，500 MHz） δ：6.613（1H，s，H-3），7.884（2H，d，J=7.2Hz，H-2′，H-6′），7.033（2H，d，J=6.8Hz，H-3′，H-5′），4.108（3H，s，OCH3），4.026（3H，s，OCH3），3.955（6H，s，2×OCH3），3.896（3H，s，OCH3）；13C-NMR（CDCl3，125 MHz）δ：162.333（C-2），106.776（C-3），177.301（C-4），144.127（C-5），138.145（C-6），151.386（C-7），148.445（C-8），147.758（C-9），114.973（C-10），123.956（C-1′），127.734（C-2′，C-6′），114.556（C-3′，C-5′），161.183（C-4′），62.258、62.021、61.820、61.647（5-、6-、7-、8-C），55.510（4′-C）。其1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)一致[12，13]，故鑒定為5，6，7，8，4′-五甲氧基黃酮（橘皮素，紅橘素，Tangeretin），分子式為C20H20O7，分子量為372。

化合物C為無色至黃綠色針狀結(jié)晶（丙酮），熔點(diǎn)134～135 ℃。1H-NMR（CDCl3，500MHz） δ：6.628（1H，s，H-3），7.414（1H，s，H-2′），6.999（1H，d，J=8.2Hz，H-5′），7.575（1H，d，J=8.5Hz，H-6′），4.110（3H，OCH3），4.030（3H，OCH3），3.984（3H，OCH3），3.971（3H，OCH3），3.958（3H，2×OCH3）；13C-NMR（CDCl3，125MHz）

δ：160.896（C-2），106.776（C-3），177.226（C-4），143.961（C-5），137.886（C-6），151.298（C-7），147.597（C-8），148.309（C-9），114.744（C-10），123.890（C-1′），108.387（C-2′），149.152（C-3′），151.783（C-4′），111.079（C-5′），

119.491（C-6′），62.152、61.855、61.726、61.572（5-、6-、7-、8-C），55.973、55.851（3′-、4′-C）。其核磁共振碳譜、氫譜數(shù)據(jù)與5，6，7，8，3′，4′-六甲氧基黃酮（川陳皮素，Nobiletin）一致[10，14]。

2.3 單體化合物活性測定

為了明確石油醚相中的抑菌活性成分，采用反復(fù)硅膠柱層析、重結(jié)晶、制備HPLC等方法對餾分F15進(jìn)行了進(jìn)一步的分離純化，獲得了3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素、川陳皮素等3個(gè)活性單體?；钚詼y定結(jié)果表明3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素、川陳皮素對蘋果腐爛病菌的EC50分別為68.19、1.56、24.02 μg/mL（表2），橘皮素可能是石油醚相中對蘋果腐爛病菌產(chǎn)生抑菌活性的主要成分。

3 小結(jié)與討論

陳皮是我國傳統(tǒng)中藥，其來源為蕓香科柑橘屬植物柑橘的果皮，富含黃酮等活性成分。多甲氧基黃酮（Polymethoxyflavones，PMFs）主要存在于蕓香科植物中，相比黃酮苷，其分子空間構(gòu)型更具平面性，極性更小，更容易穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，影響細(xì)胞的生長活動。PMFs因其良好的抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎等活性受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[15-17]。同時(shí)PMFs也是柑橘果實(shí)貯存期重要的抗病物質(zhì)，在果實(shí)采摘后可抵抗柑橘青霉菌（Penicillium digitatum）[15，18]、柑橘褐腐疫霉病菌（Phytophthora citrophthora）[19，20]等病菌的侵染，且其抗侵染能力與其含量呈正相關(guān)[21]。但PMFs對其他植物的病原菌是否有抑菌活性少有報(bào)道，Almada-Ruiz等[22]曾從柑橘的冷榨油中分離得到了4個(gè)多甲氧基黃酮類化合物，體外活性試驗(yàn)證實(shí)3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素、川陳皮素等對膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）都有較好的活性，其中橘皮素和川陳皮素在100 μg/mL時(shí)均可完全抑制膠孢炭疽菌的生長。本研究從陳皮乙醇提取物的石油醚相中分離得到了3，5，6，7，8，3′，4′-七甲氧基黃酮、橘皮素、川陳皮素等3個(gè)多甲氧基黃酮類化合物，活性測定發(fā)現(xiàn)其對蘋果腐爛病菌均有很強(qiáng)的抑菌活性，EC50分別為68.19、1.56和24.02 μg/mL。朱蔚等[23]從柑橘皮乙醇提取物中獲得了5個(gè)多甲氧基黃酮類化合物，并評價(jià)了其抑菌活性，在濃度為1 000 μg/mL時(shí)川陳皮素和橘皮素對茶樹云紋葉枯病菌并沒有明顯的抑制生長活性（抑菌圈直徑小于10 mm），這可能與川陳皮素及橘皮素的抑菌譜有關(guān)。

由蘋果腐爛病菌侵染引起的蘋果樹腐爛病在中國分布廣、危害重，是北方蘋果產(chǎn)區(qū)的第一大病害。蘋果樹腐爛病防治困難，目前的藥劑難以取得理想的效果。橘皮素等多甲氧基黃酮類化合物對蘋果腐爛病菌有較好的抑菌活性，可作為開發(fā)高效新型藥物的先導(dǎo)化合物。

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收稿日期：2014-11-15

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2010CQ026）

作者簡介：張相飛（1981-），男，山東萊陽人，實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事農(nóng)藥學(xué)研究，（電話）15953259290（電子信箱）88121029@qq.com；

通信作者，李凌緒，（電話）13455276690（電子信箱）lingxulipvi@126.com。