石蒜堿對人胃癌細(xì)胞體外增殖的影響

劉希宇, 賀小英,王鳳梅,程 騰, 馬利兵*

(1.內(nèi)蒙古科技大學(xué) 數(shù)理與生物工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014035)

0 引言

石蒜堿是中草藥中具有顯著藥理活性的重要化學(xué)成分，研究發(fā)現(xiàn)石蒜堿具有抑制乙酰膽堿酯酶、催吐、鎮(zhèn)靜、陣痛及抗腫瘤等多種生物活性[1-3]，且對多種癌細(xì)胞系以及人類白血病細(xì)胞系具有較強(qiáng)的抑制活性[4-6]，Lamoral-Theys 等研究發(fā)現(xiàn)石蒜堿主要通過抑制腫瘤細(xì)胞生長發(fā)揮抗腫瘤作用，且對腫瘤細(xì)胞的抑制活性是正常細(xì)胞的15倍[7].然而，目前尚未見有關(guān)石蒜堿對人胃癌細(xì)胞(human gastric cancer cells, hGCCs)影響的報道.基于此，本研究觀察與分析了石蒜堿對hGCCs體外增殖的影響.

1 材料與方法

1.1 試劑

EDTA、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購于杭州四季青公司，青霉素、鏈霉素購于華北制藥，石蒜堿購于西安玉泉生物科技有限公司，臺盼藍(lán)、胰蛋白酶購于Amresco公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購于Gibco公司，凱基AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，其余試劑均購于sigma公司.

1.2 hGCCs的體外培養(yǎng)及傳代

hGCCs來自于本實驗室液氮罐凍存.從液氮罐中迅速取出凍存的hGCCs，置于37 ℃水浴鍋中3～5 min，至其完全溶解，隨后，將細(xì)胞凍存液移至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，隨后，以細(xì)胞培養(yǎng)液(添加10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液)洗滌細(xì)胞2～3次，接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱(Galaxy S，購于Rs Biotech公司)中進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d更換一次培養(yǎng)液.待hGCCs達(dá)到80%～90%匯合時，倒掉培養(yǎng)液，用D-PBS洗滌細(xì)胞2～3次，采用消化液(添加體積份數(shù)0.25%胰蛋白酶和體積份數(shù)0.05%EDTA的D-PBS)消化細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌2～3次后，部分細(xì)胞凍存?zhèn)溆茫糠旨?xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，其余細(xì)胞以1.2×105個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng).

1.3 石蒜堿處理及細(xì)胞計數(shù)

向96孔培養(yǎng)板中的不同孔中添加石蒜堿，使其終摩爾濃度分別達(dá)到0、1.25、2.50及5.00 μmol/L，每24 h換液一次，并消化不同處理組一個孔中的細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液中和及臺盼藍(lán)染色后，采用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)死細(xì)胞數(shù)和活細(xì)胞數(shù).不同處理組每次計數(shù)均重復(fù)4次，每24 h計數(shù)1次，連續(xù)計數(shù)9 d，繪制hGCCs的生長曲線圖并利用公式(1)計算細(xì)胞活力.

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1.4 石蒜堿處理及流式細(xì)胞技術(shù)檢測

接種于60 mm培養(yǎng)皿中的hGCCs，分別以0、1.25、2.50、5.00 μmol/L濃度的石蒜堿處理48 h，按凱基AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒操作步驟處理各組樣品.處理后的樣品采用流式細(xì)胞儀(BD FACSCanto TM II，購于BD公司)檢測處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞比例.

1.5 數(shù)據(jù)分析

對細(xì)胞計數(shù)法統(tǒng)計得出的死細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞活力進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，檢驗其差異是否顯著，當(dāng)p<0.05表示差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 體外培養(yǎng)的hGCCs形態(tài)特征

在倒置顯微鏡下觀察，hGCCs為貼壁依賴型細(xì)胞，培養(yǎng)24 h已處于貼壁狀態(tài)，此時細(xì)胞形態(tài)為不規(guī)則多邊形或三角形(見圖1 A).隨著培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞逐漸呈上皮樣或不規(guī)則多邊形狀，且體積有所變大，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 d后hGCCs在培養(yǎng)皿中排列密集，鋪滿培養(yǎng)皿底部，部分區(qū)域會呈現(xiàn)出層疊生長的現(xiàn)象(圖1 B)，表明hGCCs已失去接觸抑制性，對其繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，hGCCs會出現(xiàn)堆砌生長，層疊數(shù)可以不斷增加.

A. 貼壁后的hGCCs； B. 層疊生長的hGCCs圖1 體外培養(yǎng)的hGCCsFig.1 hGCCs cultured in vitro

2.2 石蒜堿處理對hGCCs體外增殖的影響

為了定量研究不同濃度石蒜堿對體外培養(yǎng)的hGCCs生長的抑制作用，采用細(xì)胞計數(shù)法，對不同處理組、不同處理時間的hGCCs總數(shù)進(jìn)行計數(shù)，繪制hGCCs體外增殖曲線圖，結(jié)果見圖2.

圖2 不同濃度石蒜堿處理后hGCCs的生長曲線Fig.2 The growth curve of hGCCs after treatment with different concentration of lycorisradiata alkali

由圖2可以看出，不同濃度的石蒜堿對hGCCs的體外生長均具有一定的抑制作用，且隨著石蒜堿濃度的升高，抑制作用越發(fā)明顯.

為了進(jìn)一步探究石蒜堿抑制hGCCs體外增殖的機(jī)理，不同濃度石蒜堿處理4～7 d后的hGCCs，經(jīng)臺盼藍(lán)染色后，采用細(xì)胞計數(shù)法統(tǒng)計死細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)，并據(jù)此計算細(xì)胞活力，結(jié)果見表1和表2.

表1不同濃度石蒜堿處理后hGCCs死細(xì)胞數(shù)、活細(xì)胞數(shù)
Tab.1TheamountoflivingordeadhGCCsaftertreatmentwithdifferentconcentrationoflycorisradiataalkali

注：同一列中上標(biāo)不同字母表示差異顯著

由表1可以看出，不同濃度石蒜堿處理組的活細(xì)胞數(shù)顯著(p<0.05)低于空白對照組的活細(xì)胞數(shù)，且這種差異隨著石蒜堿濃度的增加、培養(yǎng)天數(shù)的延長而越發(fā)顯著；同時，5.00 μmol/L處理組的活細(xì)胞數(shù)顯著(p<0.05)低于1.25 μmol/L 處理組；而處理組與空白對照組在死細(xì)胞數(shù)上差異不顯著.這一結(jié)果表明，石蒜堿對hGCCs的主要影響在于其抑制hGCCs的快速增殖，且隨著石蒜堿濃度的升高，抑制作用增強(qiáng).

由表2可以看出，隨著石蒜堿濃度的增加及培養(yǎng)時間的延長，hGCCs的細(xì)胞活力顯著(p<0.05)低于空白對照組的細(xì)胞活力，這一結(jié)果表明石蒜堿處理會一定程度導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率上升.

2.3 石蒜堿處理對hGCCs細(xì)胞周期的影響

表2不同濃度石蒜堿處理后hGCCs活力
Tab.2ThevitalityofhGCCsaftertreatmentwithdifferentconcentrationoflycorisradiataalkali

注：同一列中上標(biāo)不同字母表示差異顯著

為了探究石蒜堿抑制hGCCs快速增殖的機(jī)理，體外培養(yǎng)的hGCCs經(jīng)不同濃度石蒜堿處理2 d后，經(jīng)凱基AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒預(yù)處理后，經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞比例，結(jié)果見圖3.

(A.空白組；B.1.25 μmol/L處理組，C.2.5 μmol/L處理組，D.5 μmol/L處理組)圖3 石蒜堿處理后hGCCs中處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞比例Fig.3 The proportion of hGCCs in different cell cycles after treatment with different concentration of lycorisradiata alkali

由圖3可以看出，經(jīng)不同濃度石蒜堿處理2 d后的hGCCs，處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞比例明顯不同.隨著石蒜堿濃度的升高(分別為0、1.25、2.50、5.00 μmol/L)，二倍體細(xì)胞的比例逐漸減低(分別為97.29%、90.14%、85.48%、82.48%)，而四倍體細(xì)胞的比例逐漸升高(分別為2.71%、9.86%、14.52%、17.52%).這一結(jié)果表明，石蒜堿處理可抑制hGCCs由G2期向M期過渡，從而使細(xì)胞阻滯于G2期，最終導(dǎo)致hGCCs的快速增殖受到抑制.

3 討論

癌癥的難以治愈性主要表現(xiàn)在其可以無限繁殖，且不受生長空間的限制，和癌細(xì)胞的遷移漂變性[8-9].在控制癌細(xì)胞瘋狂生長時，一方面要抑制其快速增殖，另一方面要控制其正常調(diào)亡.當(dāng)癌細(xì)胞可以控制在正常調(diào)亡時，一段時間之后，癌癥的病理特征就會減少，從而達(dá)到治療的效果[10-11].石蒜堿作為抑制癌癥細(xì)胞增殖的藥物，主要作用機(jī)理是使癌細(xì)胞阻滯于G2期，從而導(dǎo)致其快速增殖受到抑制；同時對控制細(xì)胞正常凋亡的相關(guān)酶類的合成產(chǎn)生影響，從而達(dá)到細(xì)胞凋亡控制的效果.

本實驗采用血球計數(shù)板計數(shù)法統(tǒng)計了不同濃度石蒜堿處理下的hGCCs細(xì)胞總數(shù)，并進(jìn)一步計算出細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)石蒜堿處理會抑制hGCCs的體外增殖，且較高濃度處理的hGCCs的活力最低，同時發(fā)現(xiàn)石蒜堿處理會一定程度導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率上升.用流式細(xì)胞儀分析經(jīng)PI染色后的細(xì)胞懸液，發(fā)現(xiàn)處理hGCCs的培養(yǎng)液中石蒜堿含量越大，hGCCs中二倍體細(xì)胞占有量越少，四倍體細(xì)胞占有量越多.細(xì)胞周期過程中，細(xì)胞分裂間期主要是正常的二倍體細(xì)胞，為細(xì)胞分裂復(fù)制DNA和合成蛋白質(zhì)類酶類物質(zhì)；分裂期的細(xì)胞會表現(xiàn)出短暫的四倍體細(xì)胞現(xiàn)象.正常情況下細(xì)胞間期時間遠(yuǎn)長于分裂期，從而使二倍體細(xì)胞數(shù)量多于四倍體細(xì)胞數(shù)量.檢測結(jié)果顯示hGCCs在細(xì)胞分裂期(M期)停留時間變長，表現(xiàn)hGCCs“四倍體”數(shù)目變多，hGCCs周期變長，hGCCs增殖速率隨之變慢.