續(xù)斷片及其鹽炙品高效液相指紋圖譜

羅 君，卿 娟，張麗艷，張麗麗

(1.貴陽中醫(yī)學院 第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001；2.貴州省修文縣疾病預防控制中心，貴州 貴陽550200；3.貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽550001)

0 引言

續(xù)斷為續(xù)斷科植物川續(xù)斷(DipsacusasperWall.ex Henry)的干燥根，始載于《神農本草經》，現(xiàn)收載于《中國藥典》2010版[1]；主要分布于四川、湖北、湖南、貴州等地.具有補肝腎、強筋骨、續(xù)折傷、止崩漏之功效.近年其需求量呈逐年遞增趨勢.目前，雖有續(xù)斷藥材指紋圖譜[2-4]及其不同炮制方法的報道[5-6]，但僅限于藥材和炮制工藝的研究；然臨床上常以其酒炙和鹽炙品入藥，而續(xù)斷片和鹽續(xù)斷指紋圖譜研究尚未見報道.采用指紋圖譜能夠相對全面、整體地反映藥材中化學成分的分布情況.鑒于此，我們在前期研究炮制工藝的基礎上炮制10批不同產地鹽續(xù)斷，建立能夠表征續(xù)斷片和鹽續(xù)斷的 HPLC指紋圖譜，以期為科學評價和控制續(xù)斷鹽炙前后飲片質量提供科學依據(jù).

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫.續(xù)斷藥材經貴陽中醫(yī)學院魏升華副教授鑒定為續(xù)斷科植物川續(xù)斷的干燥根(見表1)，經測定樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ、浸出物含量均符合《中國藥典》要求.川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品(批號為111685-201003)、綠原酸對照品(批號0753-200111)均購于中國食品藥品檢定研究院.乙腈，色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司；其余試劑均為分析純.

表1 續(xù)斷樣品來源Tab.1 Sample source of D. asper

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

續(xù)斷片的炮制：將續(xù)斷藥材洗凈，潤透，切厚片，干燥.鹽續(xù)斷的炮制：分別取10批續(xù)斷片，各50 g，用 2%的食鹽水(2 kg食鹽/100 kg續(xù)斷片，食鹽用4倍量水溶解)浸潤2 h，140 ℃炒20 min，取出放冷，粉碎，過80目篩，即得鹽續(xù)斷，干燥備用.

1.2.2 對照品溶液的制備

取經五氧化二磷干燥12 h的綠原酸和川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，精密稱定，用甲醇制成對照品溶液，濃度分別為0.434 0和0.151 6 g·L-1.

1.2.3 供試品溶液的制備

取續(xù)斷片和鹽續(xù)斷各0.5 g，置100 mL具塞錐形瓶中，加入體積分數(shù)30%乙醇溶液25 mL，搖勻，密塞，稱質量.超聲提取(250 W，33 kHz)30 min，放冷，再稱質量，用30%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過.各精密吸取濾液5 mL移至25 mL量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，濾過，濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得續(xù)斷片和鹽續(xù)斷供試液.

1.3 色譜條件

Agilent C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相梯度洗脫及檢測波長，見表2，柱溫25 ℃，流速1.0 mL· min-1，進樣量10 μL.

表2 流動相梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution program of mobile phase

2 結果與討論

2.1 相關實驗結果

2.1.1 精密度

取續(xù)斷片2號樣品，按“1.2.3”項下制備供試品溶液，按“1.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次.其共有峰的相對保留時間的RSD值小于0.11%，相對峰面積的RSD值均小于2.73%，表明儀器精密度好.

2.1.2 穩(wěn)定性

取“2.1.1”項下供試液，分別于0、4、8、12、24、36 h分別進樣，其共有峰的相對保留時間的RSD值小于0.23%，相對峰面積的RSD值小于4.19%.表明供試液在36 h內穩(wěn)定性良好.

2.1.3 重復性

取同批續(xù)斷片樣品6份，按“1.2.3”項下制備供試品溶液，按“1.3”項下色譜條件進樣.其共有峰的相對保留時間的RSD小于0.15%，相對峰面積的RSD值均小于4.55%，表明該方法重現(xiàn)性良好.

2.2 討論

2.2.1 提取溶劑選擇

實驗中對親脂性和親水性溶劑進行考察.以氯仿、乙酸乙酯-丙酮溶劑為溶劑時，色譜峰極少，難以較全面地反映續(xù)斷的內在化學成分信息.以水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇等為提取溶劑，30%乙醇溶液時色譜峰較多，峰型較好，能更好地反映續(xù)斷飲片的化學信息.

2.2.2 提取方法考察

對比了回流和超聲兩種提取方法，結果二者色譜圖基本一致，且峰面積差異不顯著，從節(jié)約能源及操作便捷考慮，選擇超聲法提取.

2.2.3 提取時間考察

分別對15、30、45 min不同提取時間進行了比較.結果表明，30 min較15 min色譜峰峰數(shù)多，對應色譜峰的峰面積大；但45 min與30 min其色譜峰數(shù)及其對應色譜峰峰面積差異不明顯，故選擇30 min作為提取時間.

2.2.4 流動相系統(tǒng)的選擇

對比了甲醇-水，乙腈-水，乙腈-0.05%磷酸水，乙腈-0.1%磷酸水4種流動相系統(tǒng)，結果表明乙腈-0.05%磷酸水系統(tǒng)能達到較好的洗脫效果，色譜峰峰型和分離度較好，且基線平穩(wěn).

2.2.5 色譜柱的選擇

考察了Hypersil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)，Diamonsil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)，Agilent C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)的等色譜柱.其中以Agilent C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)的分離度好，且基線平穩(wěn).

2.2.6 柱溫、流速及檢測波長考察

分別在25 ℃和30 ℃條件下對供試液進行了檢測，結果顯示30 ℃條件下部分色譜峰發(fā)生重疊，分離效果較差，故選擇25 ℃作為檢測溫度.考察了1.0 mL·min-1及0.8 mL·min-1流速下色譜峰的分離情況，結果發(fā)現(xiàn)0.8 mL·min-1的色譜圖與1.0 mL·min-1流速的分離效果相當，但0.8 mL·min-1會延長分離時間，故選擇1.0 mL·min-1進行檢測.

2.2.7 全波長掃描的三維和等高圖譜

為了全面反應色譜峰信息，利用DAD檢測器對供試液在190～400 nm波長范圍進行采集，分析其全波長掃描的三維和等高圖譜，結果顯示在210 nm條件下色譜峰信息較多，但因210 nm接近末端吸收，在梯度洗脫的情況下，供試品溶液的提取溶劑會引入溶劑峰，影響樣品分析，且通過分析發(fā)現(xiàn)在溶劑峰段樣品在240 nm波長下色譜峰的響應信號更明顯，無溶劑峰干擾，故采用分段波長對樣品的色譜圖進行采集.

2.2.8 續(xù)斷片及鹽續(xù)斷指紋圖譜特征峰的確立、指認及參照峰的選擇

比較10批續(xù)斷片和鹽續(xù)斷指紋圖譜所采集數(shù)據(jù)，結果見圖1和圖2.

圖1 10批續(xù)斷片指紋圖譜疊加Fig.1 HPLC overlapping chromatograms for ten batches of D. asper

由圖1和圖2可知，其中29個色譜峰為其共有，因此確定這29個色譜峰為續(xù)斷片和鹽續(xù)斷指紋圖譜的共有峰.在固定色譜條件下，通過對照品溶液的保留時間和紫外吸收光譜圖，可以確定指紋圖譜中7號峰為綠原酸，26號峰為川續(xù)斷皂苷Ⅵ，見圖3.川續(xù)斷皂苷Ⅵ為續(xù)斷的有效成分，且其在指紋圖譜中峰面積較大，分離較好，出峰時間穩(wěn)定，故選擇川續(xù)斷皂苷Ⅵ為參照峰.

圖2 10批鹽續(xù)斷指紋圖譜疊加Fig.2 HPLC overlapping chromatograms for ten batches of salt-processed of D. asper

圖3續(xù)斷片(S1),川續(xù)斷皂苷Ⅵ(S2),綠原酸(S3)，鹽續(xù)斷(S4)HPLC
Fig.3HPLCchromatogramsofD.asper(S1)、asperosaponinⅥ(S2)、Chlorogenicacid(S3)andprocessed(S4)

2.2.9 相似度評價分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004 A版)，對10批續(xù)斷片和鹽續(xù)斷的指紋圖譜進行相似度分析(中位數(shù)法)，得10批續(xù)斷片和鹽續(xù)斷的相似度，結果見表3.

表3 相似度分析結果Tab.3 Result of grading by similarity analysis

2.2.10 續(xù)斷片聚類分析

將10批續(xù)斷片指紋圖譜中共有峰的峰面積利用SPSS軟件進行系統(tǒng)聚類分析，聚類方法為組間連接，以Euclidean距離平方作為度量標準，10批樣品作為變量，得到聚類分析圖，見圖4.相似度結果表明，10批續(xù)斷片相似度存在差異，這種差異可能是樣品來源本身的差異，同一省份樣品差異較小，說明續(xù)斷藥材質量具有明顯的地域性，其中以四川產續(xù)斷相似度較好，一定程度上反映了川產續(xù)斷的特性.

圖4 續(xù)斷片聚類分析圖 Fig.4 Clustering analysis diagram of D.asper

2.2.11 續(xù)斷鹽制前后代謝輪廓差異分析

將10批續(xù)斷片和鹽續(xù)斷樣品通過主成分分析，取第一、第二主成分做得PCA打分圖(見圖5).

圖5 續(xù)斷片(1～10)和鹽續(xù)斷(11～20)PCA圖Fig.5 Principal component analysis diagram of D.asper (1～10)and salt-processed(11～20)

圖5中樣品離散程度較大，說明樣品間存在較大差異，此差異來源于樣品本身.結合聚類分析圖，發(fā)現(xiàn)同批次的續(xù)斷片和其炮制品鹽續(xù)斷間基本可聚在一起，從指紋圖譜“模糊性”的角度說明鹽炙對續(xù)斷中的化學成分影響不明顯.

3 討論

通過加權評分法綜合考察了影響續(xù)斷鹽炙工藝的因素，鹽制后較炮制前川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量和水溶性浸出物含量明顯增加，絕大多數(shù)峰面積有顯著變化.不同來源續(xù)斷片之間化學成分組成差異不明顯，但含量差異較大.

中藥的藥理活性表現(xiàn)為多種組分的協(xié)同效應，不僅與所含的有機成分有關，還與無機元素密切相關[7-8]，通過炮制前后色譜圖比較，尚未發(fā)現(xiàn)色譜峰數(shù)目的減少與增加，同時，有學者認為Zn和Mn等是歸腎經的物質基礎[9]，因此，鹽制續(xù)斷對其功效的影響可能來自輔料本身或者是炮制品中微量元素的變化.這可能是其與有效成分發(fā)揮協(xié)同作用的原因之一，有待進一步研究.

有研究報道，除四川、湖北等省外，其他省份生產的續(xù)斷含量未達到《中國藥典》標準；結合本文研究結果，同一省份樣品相似度差異較小，表明續(xù)斷藥材質量具有地域性，其中以四川產續(xù)斷相似度較好；同時，我們對其含量進行了測定，均符合《藥典》標準，一定程度上反映了四川產續(xù)斷的特性，鑒于樣品量的限制，有待進一步研究.

4 結論

本研究建立的續(xù)斷片及其鹽炙品高效液相指紋圖譜，具有較好的專屬性、重現(xiàn)性等特點，有利于全面、科學地控制續(xù)斷片及鹽續(xù)斷的質量，可進一步為其質量控制提供科學依據(jù).