骨髓胚胎樣干細胞體內重建dystrophin的表達

龐榮清，王強，楊建勇，朱光旭，李自安，何潔，朱向情，阮光萍，潘興華

骨髓胚胎樣干細胞體內重建dystrophin的表達

龐榮清，王強，楊建勇，朱光旭，李自安，何潔，朱向情，阮光萍，潘興華

目的觀察骨髓胚胎樣干細胞體內再生dystrophin的可行性。方法采用SSP-PCR方法鑒定mdx小鼠的基因型。分離擴增人骨髓胚胎樣干細胞，采用DIR標記后，注射細胞到mdx小鼠腹股溝三角皮下，采用活體成像法觀察植入細胞的存活情況，采用免疫熒光染色法檢測dystrophin的表達。結果雜合子鼠交配可以產生3個基因型的子代鼠，采用SSP-PCR可以鑒定出mdx小鼠基因型；采用無血清培養(yǎng)基可從骨髓中分離到表達SSEA-4和FZD-9的胚胎樣干細胞，可在注射細胞的mdx小鼠離體后肢肌肉檢測到明顯的熒光信號，并在肌肉組織中檢測到人dystrophin的表達。結論人骨髓胚胎樣干細胞可在mdx小鼠體內存活并表達dystrophin。

骨髓；胚胎樣干細胞；mdx小鼠；基因型；dystrophin；Duchenne型肌營養(yǎng)不良

Duchenne型肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是臨床上常見的神經內科遺傳病，目前尚無有效治療方法[1]。研究DMD治療、尤其是干細胞治療，mdx小鼠是常用的動物模型[2]。本課題前期研究[3]表明，從骨髓中可以分離獲得表達多潛能抗原標志的胚胎樣干細胞(embryonic-like stem cells，ELSCs)，這些細胞已成為目前成體干細胞生物學研究的一個亮點。本實驗以mdx小鼠為研究對象，探討骨髓胚胎樣干細胞在體內再生dystrophin的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑器材DMD模型種鼠(牛津大學Davies教授惠贈，檢疫許可證號AD44010011)，飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)動物實驗室[SYXK(滇)2013-0011]；無血清培養(yǎng)基和trypsin-EDTA均為invitrogen公司生產；一抗鼠抗人dystrophin和FITC標記的羊抗鼠IgG均為Santa Cruz公司生產；細胞膜熒光探針DIR碘化物為北京泛博生化有限公司生產；活體成像儀為Maestro in vivo imaging system。

1.2 mdx小鼠鑒定種鼠生產的子代鼠，采集其外周血提取基因組DNA。按本課題組建立的序列特異性引物(sequence specific primers，SSP)-PCR法進行基因型鑒定[4]。上游引物：5′-GTGAAGGATGTCATGAAA G-3′，下游引物1：5′-TGAAGTCCGAAAGAGATACC-3′，下游引物2：5′-ACGAGACTAGTGAGACGTGC-3′。PCR反應條件為：95℃5min，94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，溴化乙錠染色后紫外燈下觀察拍照。

1.3 ELSCs的準備按照本課題組建立的方法[3]分離擴增ELSCs，即采集人骨髓，無菌條件下分離骨髓單個核細胞，加入無血清培養(yǎng)基重懸單個核細胞后，轉移到明膠包被過的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)基是含有20%SR、2mM glutamine、1%NEAA、0.1mM 2-mercaptoethanol和5 ng/ml bFGF的k-DMEM培養(yǎng)液。加入0.1%明膠溶液至培養(yǎng)瓶中靜置30 min，吸棄明膠溶液后自然風干，即可包被培養(yǎng)瓶。光學顯微鏡下觀察細胞生長情況及形態(tài)特征。適時換液并及時用trypsin/EDTA消化傳代細胞。第3代ELSCs用于實驗研究。

1.4 細胞注射及活體成像觀察參照文獻[5]報道方法，加入0.1%DIR溶液與生長良好的第3代細胞共培養(yǎng)8 h，收集并調整細胞密度為1×106/ml，在用于實驗研究的mdx小鼠腹股溝三角皮下注射2 ml細胞懸液，對照mdx小鼠注射無細胞的等量基礎培養(yǎng)液。1個月后處死小鼠，取其后肢去除皮膚后，于活體成像儀下拍照。

1.5 人dystrophin的檢測參照本課題組建立的技術方法[4]，處死小鼠取少許股直肌肌肉制作冰凍切片，室溫條件下加入10%正常羊血清封閉1 h，滴加一抗mouse anti-human dystrophin 4℃孵育過夜，漂洗后加入二抗FITC-goat anti-mouse IgG于室溫反應1 h，漂洗后，熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 mdx小鼠的鑒定采用SSP-PCR方法可以準確地將子代小鼠鑒定為3種基因型，其中只擴增出一個340 bp條帶的小鼠（圖1），即為表達utrophin基因而不表達dystrophin基因的mdx小鼠，適于干細胞治療實驗研究。

圖1 3種基因型小鼠的SSP-PCR電泳圖

2.2 ELSCs的分離培養(yǎng)采用無血清培養(yǎng)基在明膠包被過的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)骨髓單個核細胞，可分離到貼壁生長、體積較小、形態(tài)纖細的細胞，即ELSCs（圖2A），細胞傳代后在瓶中均勻分布生長（圖2B）。流式分析顯示ELSCs表達SSEA-4和FZD-9。

圖2 ELSCs的形態(tài)特征及流式分析

2.3 活體成像觀察注射DIR標記細胞的mdx小鼠，在去除皮膚的后肢股直肌和腓腸肌等部位可以檢測到明顯的熒光信號，而沒有注射細胞的對照鼠后肢肌肉則檢測不到熒光信號的存在（圖3）。

圖3 離體mdx小鼠后肢熒光成像分析

2.4 熒光免疫染色分析皮下注射ELSCs的mdx小鼠，1個月后檢測到了人dystrophin的表達，而沒有注射細胞的對照小鼠只觀察到極其微弱的熒光背景，檢測不到dystrophin的表達（圖4）。

3 討論

由于位于X染色體上的dystrophin基因突變或缺失，導致dystrophin蛋白表達障礙，是DMD發(fā)病的主要原因。位于肌細胞膜上的dystrophin蛋白與肌纖維膜糖蛋白結合為抗肌萎縮蛋白復合體，這些蛋白與肌細胞的黏附蛋白聯(lián)結，共同構成細胞支架，共同維持著肌纖維的穩(wěn)定[6]。表達utrophin基因而不表達dystrophin基因的mdx小鼠，雖然基因代償?shù)木壒势渑R床癥狀不如臨床上DMD患者那樣嚴重，但這種小鼠能夠長期存活，仍然成為DMD研究最常用的動物模型。

圖4 人dystrophin熒光免疫染色分析

干細胞移植治療DMD的原理，就是通過輸入健康供體來源的干細胞到DMD體內，以重建dystrophin蛋白的表達。我們已經從骨髓中可以分離獲得表達多潛能抗原標志的ELSCs，并證明ELSCs具有較強的成肌分化能力[3]。本研究采用前期研究建立的無血清培養(yǎng)方法分離獲得ELSCs，將其用DIR標記后注射到mdx小鼠腹股溝三角皮下，可以在mdx小鼠后肢肌肉豐富的區(qū)域檢測到明顯的熒光信號，表明注入皮下的細胞可以就近分布到肌肉豐富的區(qū)域定植；免疫熒光檢測分析可以檢測到人dystrophin的表達，表明人骨髓來源的ELSCs可在mdx小鼠體內再生dystrophin，這與研究報道一致[7]。

ELSCs之所以引人關注，主要原因就是它們能表達多潛能的抗原標志，如VSEL被認為是成體組織中真正意義上的干細胞，是再生醫(yī)學研究中真正的種子細胞[8]。流式分析顯示：ELSCs表達SSEA-4和FZD-9，前者是胚胎干細胞的抗原標志[9]，后者雖不是多潛能抗原標志，但FZD-9陽性的細胞表達了更多的多潛能抗原標志[10]，說明FZD-9與多潛能抗原標志的表達有關。本研究檢測到人源dystrophin在mdx的表達，說明ELSCs有可能被用于DMD的治療，而前期研究表明，ELSCs擁有更強的成肌分化能力，說明ELSCs可能是DMD治療更好的種子細胞。

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[5]張佳琳，熊曄蓉，涂家生.精氨酸水溶液復溶的多西他賽聚合物膠束的體外藥效學及體內分布[J].藥學與臨床研究, 2013,21(3):224-226.

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Expression of dystrophin reconstructed by bonemarrow embryonic-like stem cells in vivo

Pang Rongqing,Wang Qiang,Yang Jianyong,Zhu Guangxu,Li Zian,He Jie,Zhu Xiangqing,Ruan Guangping,Pan Xinghua Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Command/The Nation and Region Integrated Engineering Laboratory of Stem Cell and Immunocyte Biological Technology/Key Laboratory of Cell Therapeutic Transforming Medicine of Yunnan Province/Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province,Kunming,Yunnan,650032,China

Objective To observe the feasibility of the dystrophin regeneration by bone marrow embryonic-like stem cells (ELSCs)in vivo.Methods SSP-PCR was used to identify the mdx mice's genotype.Human bone marrow embryonic-like stem cells were separated,isolated,and then after the marking by DIR,subcutaneously injected into the mdx mice's inguinal triangle.The survival of implanted cells was observed by living-imagingmethod,and the dystrophin expression was detected by immunofluorescent staining method.Results The copulation of heterozygousmice could breed offspring with three kinds of genotype.The genotype of mdx mice could be identified by SSP-PCR.ELSCs expressing SSEA-4 and FZD-9 could be isolated from the bone marrow through serum-free medium.Significant fluorescence signal was detected in the ex vivo posterior limb muscle of the mdx mice that were injected with the cells,and the expression of dystrophin was detected in the muscle tissues.Conclusion Human bone marrow embryonic-like stem cells can survivewithinmdxmice and express dystrophin.

bonemarrow;serum-freemedium;mdxmouse;genotype;dystrophin;Duchennemuscular dystrophy

R 318.1

A

1004-0188（2015）08-0823-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2015.08.004

2015-04-10）

云南省基金項目(2011HB050,2013DA004,2013CA005)；成都軍區(qū)基金項目（2012WJ003)；國家自然科學基金項目（31172170）

650032昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細胞生物治療中心,干細胞與免疫細胞生物醫(yī)藥技術國家地方聯(lián)合工程實驗室,云南省細胞治療技術轉化醫(yī)學重點實驗室,云南省干細胞工程實驗室

潘興華，電話:0871-64774773；E-mail:xinghuapang@ aliyun.com