擬絲孢鐮刀菌侵染對馬鈴薯塊莖生理生化特性的影響

趙慧 袁強(qiáng) 蔣先鋒 張?jiān)? 史麗娟 呂文河 李鳳蘭

摘要：馬鈴薯干腐病是馬鈴薯貯藏期主要病害之一，已經(jīng)成為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)主要限制因子，確定病原菌的侵染特性對于早期預(yù)報(bào)和防治干腐病具有重要的意義。對馬鈴薯干腐病主要致病菌擬絲孢鐮刀菌（Fusarium trichothecioides）侵染馬鈴薯過程中薯塊的生理生化特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，不同抗性的馬鈴薯被擬絲孢鐮刀菌侵染后，丙二醛（MDA）含量都出現(xiàn)出下降的趨勢，而超氧化物歧化酶（SOD）活性對薯塊抵抗病原菌的侵染起到了一定的作用，可溶性蛋白質(zhì)含量和過氧化物酶（POD）活性和抗病性密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯抗性；擬絲孢鐮刀菌（Fusarium trichothecioides）；超氧化物歧化酶；過氧化物酶；丙二醛

中圖分類號：S435.32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）10-2380-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.08.019

馬鈴薯是糧食、蔬菜、飼料和工業(yè)原料兼用的主要農(nóng)作物，具有豐產(chǎn)性好、適應(yīng)性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益高和營養(yǎng)豐富的特點(diǎn)，為解決中國經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的溫飽問題和糧食安全問題做出了重要貢獻(xiàn)，在促進(jìn)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、優(yōu)化區(qū)域布局和抗災(zāi)救災(zāi)中發(fā)揮了重要作用[1]。近年來，中國馬鈴薯種植面積不斷擴(kuò)大，種植面積和總產(chǎn)量均占世界的1/4，已成為中國的第四大糧食作物，中國已成為世界馬鈴薯第一生產(chǎn)大國[2]。在北方地區(qū)，馬鈴薯無論作為商品薯還是種薯，冬季儲藏方式都是以窖藏為主，在儲藏期間由于儲藏條件的不適宜，常會導(dǎo)致某些病害的加重，如晚疫病、環(huán)腐病、干腐病、黑心病及軟腐病等發(fā)生，嚴(yán)重的會出現(xiàn)爛窖，極大地影響了馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，對馬鈴薯的生產(chǎn)和銷售都帶來很大的影響[3-5]。隨著種植面積不斷擴(kuò)大，馬鈴薯的各種病害日趨嚴(yán)重，成為限制馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素，其中馬鈴薯干腐病是馬鈴薯貯藏期主要病害之一，因馬鈴薯干腐病導(dǎo)致窖貯損失率可高達(dá)60%[6]，該病已成為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸問題[7]。

前人對馬鈴薯干腐病的研究大部分集中在病原菌的分離鑒定和防治上[8]，對于馬鈴薯干腐病和馬鈴薯二者互作機(jī)制尚不是十分清楚，對于鐮刀菌（Fusarium sp.）侵染馬鈴薯過程中的細(xì)胞、生理生化變化特點(diǎn)及遺傳特性等方面報(bào)道較少[9-11]。對馬鈴薯干腐病的防治目前主要采用化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行化學(xué)防治，主要目的是減輕馬鈴薯干腐病的危害程度，難以有效控制病害發(fā)生，使用不當(dāng)還會導(dǎo)致食品安全、馬鈴薯藥害和環(huán)境污染問題，尚未找到防治干腐病的有效方法，究其原因是對于防治缺乏理論基礎(chǔ)，存在較嚴(yán)重的盲目性。解決馬鈴薯干腐病防治問題行之有效的方法是在充分掌握馬鈴薯與鐮刀菌互作機(jī)制的基礎(chǔ)上[12，13]，了解馬鈴薯的感病實(shí)質(zhì)，從而選擇切實(shí)有效并且可行的防治方法對馬鈴薯干腐病進(jìn)行防治[14]。

馬鈴薯干腐病是由鐮刀菌引起的，病原菌為鐮刀菌屬（Fusarium）的多種真菌。適宜發(fā)病的溫濕度范圍較寬，5～30 ℃均能導(dǎo)致馬鈴薯發(fā)病。高溫、高濕有利于發(fā)病，在貯藏條件差、通風(fēng)不良環(huán)境利于此病的發(fā)生[15]，早熟品種比晚熟品種易發(fā)病[16]。黑龍江省馬鈴薯干腐病主要病原有6個(gè)種及變種，分別為接骨木鐮刀菌（Fusarium sambucinum）、燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）、擬絲孢鐮刀菌（Fusarium trichothecioides）、茄病鐮刀菌藍(lán)色變種（Fusarium solani var. coeruleum）、茄病鐮刀菌（Fusarium solani）、擬枝孢鐮刀菌（Fusarium sporatrioides）、黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）。其中致病力較強(qiáng)的為接骨木鐮刀菌、燕麥鐮刀菌和擬絲孢鐮刀菌[17，18]。本試驗(yàn)以擬絲孢鐮刀菌為致病菌，對馬鈴薯與擬絲孢鐮刀菌的互作過程中塊莖主要防御物質(zhì)——超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）和可溶性蛋白質(zhì)變化進(jìn)行測定，探討擬絲孢鐮刀菌侵染過程中馬鈴薯的抵御作用，闡述馬鈴薯與鐮刀菌的互作機(jī)理，為科學(xué)防治馬鈴薯擬絲孢鐮刀菌病害、選育和培育具有廣譜抗病性的馬鈴薯品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯選用黑龍江省馬鈴薯主栽品種克山1號（K1，抗性品種）、大西洋（Altantic，感病品種）的脫毒薯塊（原原種）為寄主材料。供試病原菌為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存的擬絲孢鐮刀菌，保存于PDA培養(yǎng)基上。

1.2 方法

用打孔器在擬絲孢鐮刀菌活化培養(yǎng)基上將菌體做成菌餅待用。在無菌操作臺中將馬鈴薯塊莖表面消毒，去皮后用刀將其切成5 mm的薄片，薄片直徑為3 cm。然后將菌餅放在馬鈴薯薄片中心位置，放入平皿中，以不接種的為對照。 25 ℃恒溫培養(yǎng)。6、12、24、48、72 h取樣，每次取樣1.0 g，3個(gè)重復(fù)。所取樣品迅速用錫紙包上，做好標(biāo)記后放入液氮中速凍，保存于-80 ℃冰箱中。采用酶-蛋白聯(lián)合測定法[19]測定生理生化指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬絲孢鐮刀菌侵染過程中可溶性蛋白質(zhì)含量變化

采用擬絲孢鐮刀菌對大西洋和克山1號的薯塊進(jìn)行侵染，測定不同時(shí)間可溶性蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見圖1。由圖1可見，擬絲孢鐮刀菌侵染大西洋薯塊后，薯塊可溶性蛋白質(zhì)含量僅在9 h時(shí)略高于對照，其余時(shí)間均明顯低于對照，表現(xiàn)出含量隨侵染時(shí)間延續(xù)呈降低趨勢。受擬絲孢鐮刀菌侵染的克山1號薯塊可溶性蛋白質(zhì)含量除了在6 h時(shí)明顯低于對照外，其他時(shí)期含量與對照比較接近。可見，不同抗性馬鈴薯品種被擬絲孢鐮刀菌侵染后薯塊內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量變化趨勢存在差異，可溶性蛋白質(zhì)含量可能與馬鈴薯品種對擬絲孢鐮刀菌的抗性呈正相關(guān)。

2.2 擬絲孢鐮刀菌侵染過程中SOD活性變化

采用擬絲孢鐮刀菌侵染大西洋和克山1號薯塊，測定不同時(shí)間的SOD活性，結(jié)果見圖2。擬絲孢鐮刀菌侵染馬鈴薯后，大西洋和克山1號薯塊內(nèi)的SOD活性在3 h時(shí)都表現(xiàn)為降低，然后出現(xiàn)了快速升高，其中克山1號在6 h達(dá)到了最高，大西洋在9 h時(shí)達(dá)到了最高值；在9～48 h抗病品種克山1號薯塊中的SOD活性上升，而感病品種大西洋薯塊中的SOD活性處于下降的趨勢，表明在擬絲孢鐮刀菌侵染馬鈴薯薯塊后，不斷上升的SOD活性對于薯塊抵抗病原菌的侵染起到了一定的作用。

2.3 擬絲孢鐮刀菌侵染過程中POD活性變化

采用擬絲孢鐮刀菌侵染大西洋和克山1號薯塊，測定不同時(shí)間的POD活性，結(jié)果見圖3。擬絲孢鐮刀菌侵染后大西洋和克山1號薯塊內(nèi)POD活性在0～6 h呈下降趨勢，大西洋內(nèi)POD酶活性變化較大。在6 h后，2個(gè)品種的POD活性都開始呈現(xiàn)出上升趨勢，在0～12 h抗性品種克山1號POD活性始終高于感病品種大西洋，表明這個(gè)階段POD酶活性與抗病性強(qiáng)密切相關(guān)。

2.4 擬絲孢鐮刀菌侵染過程中丙二醛含量變化

采用擬絲孢鐮刀菌侵染大西洋和克山1號薯塊，測定不同時(shí)間的丙二醛含量，結(jié)果見圖4。擬絲孢鐮刀菌侵染后，侵染組相對對照組丙二醛含量都出現(xiàn)下降趨勢，其中克山1號中的丙二醛含量的下降幅度較小，只是在24 h時(shí)出現(xiàn)了較大幅度下降，而感病品種大西洋薯塊中的丙二醛含量下降的幅度較大，在12 h時(shí)已出現(xiàn)了較大幅度下降。丙二醛含量下降的原因可能是在病原菌侵染過程中薯塊中產(chǎn)生了大量的抗氧化酶。

3 小結(jié)與討論

活性氧對植物的防御反應(yīng)十分重要，它能夠誘導(dǎo)局部植物細(xì)胞程序性死亡，啟動(dòng)細(xì)胞壁蛋白的氧化交聯(lián)，使病原限制在自殺性的寄主細(xì)胞內(nèi)，從而減緩病原的侵染[20]。植物處于逆境下，也會產(chǎn)生自由基反應(yīng)。胡景江等[21]對元寶楓進(jìn)行模擬脅迫處理，發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫條件下元寶楓的SOD活性先下降后逐漸回升至接近正常水平。耐干旱、霜凍、高鹽堿、有毒物質(zhì)等適應(yīng)性強(qiáng)的植物內(nèi)SOD活性明顯較高，SOD與植物耐逆境能力有關(guān)，通過對植物SOD的分析有助于了解植物抗逆性，可用于培養(yǎng)抗逆能力強(qiáng)、有經(jīng)濟(jì)效益的新品種[22]。過氧化物酶是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶，它與植物代謝及抗逆性都有密切關(guān)系[23，24]。它的作用具有雙重性，一是過氧化物酶可在逆境或衰老初期表達(dá)，表現(xiàn)為保護(hù)效應(yīng)；二是過氧化物酶也可在逆境或衰老后期表達(dá)，參與活性氧的生成，是植物體衰老的產(chǎn)物，甚至可作為衰老指標(biāo)[25]。丙二醛是最常用的膜脂過氧化指標(biāo)[26]。植物在逆境下遭受傷害或衰老，與活性氧積累誘發(fā)的膜脂過氧化作用密切相關(guān)，膜脂過氧化的產(chǎn)物有二烯軛合物、脂類過氧化物、丙二醛、乙烯等。其中丙二醛是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，可以通過測定丙二醛了解膜脂過氧化的程度以間接了解膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。

本研究中不同抗性馬鈴薯被擬絲孢鐮刀菌侵染后薯塊內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量變化趨勢存在差異，在感病品種中可溶性蛋白質(zhì)表現(xiàn)出下降趨勢，可溶性蛋白質(zhì)含量可能與馬鈴薯品種對擬絲孢鐮刀菌抗性呈正相關(guān)。9～48 h抗病品種克山1號薯塊中的SOD活性上升，感病品種大西洋薯塊中的SOD活性處于下降的趨勢，說明SOD對薯塊抵抗病原菌的侵染起到了一定的作用。不同抗性馬鈴薯品種受擬絲孢鐮刀菌侵染時(shí)薯塊內(nèi)POD活性變化差別較大，POD活性與馬鈴薯抗擬絲孢鐮刀菌侵染有密切相關(guān)性。相對于未被侵染薯塊，染病的馬鈴薯MDA含量出現(xiàn)了大幅度的下降。馬鈴薯在抵抗擬絲孢鐮刀菌所引起的干腐病過程中防御酶起到了至關(guān)重要的作用，被擬絲孢鐮刀菌侵染后抗性品種的各指標(biāo)測定結(jié)果均不同程度地高于未被病原菌浸染時(shí)期，表明病原菌侵染后誘導(dǎo)馬鈴薯體內(nèi)與抗干腐病有關(guān)的防御酶活性升高。本研究從防御酶活性變化方面闡明馬鈴薯抗病情況，為馬鈴薯抗病選種提供了理論依據(jù)。

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