壓熱處理對米糠蛋白功能特性的影響研究

王長遠，郝天舒

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

米糠是水稻加工過程中形成的主要副產(chǎn)物，即稻米碾磨擠壓中所碾磨出的皮層及碎米與米胚的混合物[1]。我國是產(chǎn)糧大國，每年稻谷的產(chǎn)量高達2 億t，米糠年產(chǎn)可達140 萬t，總量約占全球產(chǎn)量的1/3[2]。通常，米糠重蛋白質(zhì)含量約為12%～16%，脂肪含量約為16%～22%，水分含量約為7%～14%[3-4]。而脫脂處理后米糠的蛋質(zhì)含量可達到18%左右，是一種極有利用價值的植物源蛋白質(zhì)[5]。米糠蛋白的另一個顯著優(yōu)點是氨基酸組成配比較為合理，十分接近FAO/WHO 的推薦模式；并且米糠蛋白還是低過敏性蛋白，可安全地應(yīng)用于嬰兒食品中[6]。

雖然，米糠蛋白的營養(yǎng)功能性已廣受認可，但目前，米糠蛋白及其同類產(chǎn)品并未實現(xiàn)商品化，主要是受限于米糠蛋白的低溶解性。當今已有部分研究采用物化改性手段對米糠蛋白進行修飾，并表現(xiàn)出較為良好的效果，其中熱處理是較為廣泛使用的一種技術(shù)手段。研究采用壓熱處理對米糠蛋白進行修飾，探究壓熱處理對米糠蛋白功能性的影響，以期為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

材料：米糠蛋白，由實驗室制備（米糠蛋白蛋白含量為89.21%）；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器：手提式壓力蒸汽滅菌器，廣州康邁醫(yī)療器械有限公司；CR22G 高速冷凍離心機，日本日立公司；pHS-3D pH 計，上海雷磁公司；722 型分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；ATN-300 全自動定氮儀，上海洪紀儀器設(shè)備有限公司；JJ-1 精密增力電動攪拌器，江蘇省金壇市宏華儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 米糠蛋白的提取

粗米糠過60 目篩除去內(nèi)部雜質(zhì)，過篩后加入正己烷比例為1∶6（g·V-1），攪拌2 h，靜止3 min 后4 000 r·min-1下離心5 min 除去上清液，重復(fù)兩次脫脂處理，沉淀經(jīng)風(fēng)干處理后制得脫脂米糠用于后續(xù)研究。

脫脂米糠100 g，按料液比1∶10 加入1 000 mL水，用NaOH 溶液調(diào)pH 至9，45 ℃下恒溫水浴攪拌2 h，4 000 r·min-1下離心20 min，收集上清液，調(diào)節(jié)pH 至4.5，靜止沉淀后4 000 r·min-1離心15 min，傾去上清液，沉淀于4 ℃對蒸餾水透析48 h，沉淀真空冷凍干燥，即為米糠蛋白粉，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 壓熱處理米糠蛋白

將米糠蛋白溶解于pH 7.0 磷酸緩沖液中，配制成濃度為5%的米糠蛋白溶液，用作儲備液。然后將儲備液用標準緩沖液稀釋分裝在三角瓶中，用軟膠塞塞住瓶口避免水分蒸發(fā)。

將樣品放入手提式高壓滅菌鍋（121 ℃、0.1 MPa）中分別處理10、15、20、25、30 min，樣品處理后迅速冷卻，經(jīng)冷凍干燥后備用。

1.2.3 溶解性

蛋白的溶解性以氮溶指數(shù)表示。精確稱取2.00 g蛋白樣品，溶解于45 mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 至7.0，室溫下攪拌1 h 后，在4 000 r·min-1下離心20 min出去沉淀，測定上清液中的氮含量。

溶解度（%）=（上清液蛋白質(zhì)含量/樣品總蛋白含量）×100%

1.2.4 乳化性及乳化穩(wěn)定性

準確稱取1.00 g 樣品，加入到0.05 mol·L-1，pH 7.0 的磷酸緩沖液中，配置成1%的蛋白溶液100 mL，使之充分溶解。取75 mL 蛋白溶液與25 mL大豆油充分混合，在高速剪切乳化機下4 000 r·min-1乳化2 min，然后立刻在燒杯底部吸取20 μL 乳狀液，加入至5 mL 0.1%的SDS 溶液中混合均勻，使之稀釋250 倍，測定500 nm 下的吸光值。按下面公式計算乳化活性EAI。

EAI=2T×N×A0/（c×Φ×10 000）其中：T=2.303；

N—稀釋倍數(shù)，250；

c—乳化液未形成前蛋白質(zhì)溶液的濃度，g·mL-1；

Φ—乳化液中油相體積分數(shù)，0.25；

A0—0 min 時的吸光值。

測定蛋白的乳化穩(wěn)定性，需要等乳化液放置10 min 后，再從燒杯底部吸取液體，按如上方法測定吸光值。按下面公式計算乳化穩(wěn)定性ES。

ES=A0×t/（A0-A10）

其中：A0—0 min 時的吸光值；

A10—10 min 時的吸光值；

t—間隔時間，10 min。

1.2.5 起泡性及起泡穩(wěn)定性

取一定量米糠蛋白樣品加入到0.01 mol·L-1的pH 7.0 磷酸緩沖液中，配置成5%蛋白溶液，取200 mL 樣品，在高速均質(zhì)機下以4 000 r·min-1，攪打2 min，快速移至500 mL 量筒中，記錄0 min，15 min泡沫的高度，表示蛋白起泡能力的大小，并進行3 次重復(fù)試驗。按如下公式計算：

泡沫膨脹率（%）=（H0-H）/ H

其中，H—未攪打時溶液的高度，cm；

H0—攪打停止時泡沫的高度，cm。

泡沫穩(wěn)定性（%）=H15/H0

其中：H15—攪打停止靜置15 min 時泡沫的高度，cm。

1.2.6 表面疏水性

稱取一定量的米糠蛋白溶解于0.01 mol·L-1pH7.0 的磷酸鹽緩沖液，4 000 r·min-1離心30 min 除去沉淀，采用Lowry 法測定上清液的蛋白濃度，控制蛋白質(zhì)濃度在0.005～0.5 mol·mL-1，取不同濃度梯度的米糠蛋白溶液3 mL，分別加入ANS 溶液30 μL（8 mmol·L-1），經(jīng)振蕩處理后靜置5 min，利用熒光分光光度計測定蛋白質(zhì)樣品的熒光強度。條件為：熒光光譜的激發(fā)波長λex=370 nm，發(fā)射波長λem=490 nm，夾縫設(shè)定為5 nm。建立熒光強度與蛋白質(zhì)濃度之間的線性關(guān)系，其初始段斜率即為米糠蛋白的表面疏水值。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶解性

蛋白質(zhì)的溶解性是蛋白質(zhì)最主要功能特性，溶解性的表達在很大程度上影響著其他功能性質(zhì)，另外，蛋白質(zhì)的溶解性也會較為顯著地影響蛋白質(zhì)的商用及營養(yǎng)價值。

圖1 壓熱處理對米糠蛋白溶解性的影響Fig.1 Effects of heating with high pressure to solubility of rice bran protein

由于米糠蛋白中二硫鍵含量較多且易于聚集形成聚集體，因而米糠蛋白在水溶液中的溶解性較差，溶解度僅為47.56%。由圖1 可知，壓熱處理可以有效地提高米糠蛋白溶解性，壓熱處理米糠蛋白后，蛋白空間結(jié)構(gòu)局部展開、分子柔性得以改善，促進了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)舒張與水合作用，使米糠蛋白的溶解性得到提高。隨著壓熱處理時間的延長，米糠蛋白溶解性呈現(xiàn)先增大后降低的變化趨勢，壓熱處理20 min 時，米糠蛋白溶解性最高，溶解度可達51.36%。對于米糠蛋白在長時壓熱處理后溶解性的降低主要與部分不溶性蛋白聚集體形成有關(guān)。

2.2 乳化性

乳化性是指互不相溶的液體在機械攪拌后形成乳液的能力。乳化性是蛋白質(zhì)較為重要的表面性質(zhì)之一，這主要是由于蛋白分子鏈內(nèi)分布有較多的親水或疏水基團，親水性及疏水性基團的存在也決定了蛋白質(zhì)的表面活性特點。米糠蛋白乳化性在食品加工過程中起到了重要的作用，因此，現(xiàn)今研究多圍繞此功能性質(zhì)展開。

圖2 壓熱處理對米糠蛋白乳化性的影響Fig.2 Effects of heating with high pressure to emulsion of rice bran protein

由圖2 可知，原始米糠蛋白的乳化性約為35.6 m2·g-1，壓熱處理有效地提高米糠蛋白乳化性，并且隨著壓熱處理時間的增長呈先增大后降低的趨勢，在20 min 壓熱處理后米糠蛋白的乳化性為48.3 m2·g-1，相比于原始米糠蛋白乳化性提高了近35.6%。這主要是由于壓熱處理后米糠蛋白發(fā)生局部變性，米糠蛋白分子剛性顯著降低，米糠蛋白的分子形態(tài)逐漸由緊實球體轉(zhuǎn)變?yōu)榫€性分子，促進了米糠蛋白的柔性增加，有利于米糠蛋白更為有序地排列于油—水界面；另外，米糠蛋白在壓熱處理后蛋白質(zhì)內(nèi)部包埋的疏水性殘基逐漸暴露出來，并逐漸擴散于油—水界面，進而降低界面張力，促進了米糠蛋白乳化性的提升。但隨著壓熱處理時間的延長，米糠蛋白變性程度增加，蛋白質(zhì)聚集程度增大，維持米糠蛋白的內(nèi)部結(jié)構(gòu)力（包括氫鍵、范德華力、離子鍵等）逐漸被破壞，使油滴表面的保護層變薄，進而導(dǎo)致乳化性的降低[7]，在30 min 壓熱處理下米糠蛋白的乳化性降低至42.6 m2·g-1，但仍較高于原始米糠蛋白。

圖3 壓熱處理對米糠蛋白乳化穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of heating with high pressure to emulsion stablility of rice bran protein

通過圖3 可知，原始米糠蛋白的乳液穩(wěn)定時間約為10 min，而壓熱處理后米糠蛋白乳化穩(wěn)定性有所降低，隨著壓熱處理時間的增長，米糠蛋白乳化穩(wěn)定性逐漸降低，壓熱處理25 min 后乳化液穩(wěn)定時間僅為8.5 min。目前研究表明，蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性與乳滴粒徑大小有關(guān)，可以推測，米糠蛋白的乳化穩(wěn)定性的降低很可能是與米糠蛋白聚集造成的乳滴粒徑增大有關(guān)[8]。

2.3 起泡性

為了測試米糠蛋白的起泡性，采用泡沫膨脹率為指標進行分析。壓熱處理對米糠蛋白起泡性的影響如圖4 所示，由圖可知未經(jīng)任何處理條件下的米糠蛋白起泡性較差，這主要是由于米糠蛋白本身結(jié)構(gòu)相對致密，其內(nèi)部富含二硫鍵增加了蛋白結(jié)構(gòu)的緊實性，以至于難以分散形成泡沫[9]。

圖4 壓熱處理對米糠蛋白起泡性的影響Fig.4 Effects of heating with high pressure to foam of rice bran protein

如圖4 可知，未經(jīng)處理的米糠蛋白泡沫膨脹率為68.3%，而壓熱處理后米糠蛋白的起泡性有所提高，并總體隨時間的延長呈先增大后降低的變化趨勢，在壓熱處理25 min 時起泡性最大，此時米糠蛋白的泡沫膨脹率為159.4%。短時壓熱處理起泡性提高的原因是：泡沫的形成需要蛋白質(zhì)分子盤旋的肽鏈伸展開，通過各種相互作用在液體表面形成一層具有韌度的液膜。壓熱處理的熱效應(yīng)有助于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的展開，更多的疏水性基團暴露也促進了起泡性的提高，而長時壓熱處理后米糠蛋白的聚集收縮使其難于形成液膜，造成了米糠蛋白起泡性的降低[9]，壓熱處理30 min 后米糠蛋白泡沫膨脹率僅為126.3%。

圖5 壓熱處理對米糠蛋白起泡穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of heating with high pressure to foam stability of rice bran protein

通過圖5 可知，壓熱處理不利于米糠蛋白的泡沫穩(wěn)定性的維持，原始米糠蛋白的泡沫穩(wěn)定性較強，為69.1%，而壓熱處理30 min 后米糠蛋白的泡沫穩(wěn)定性僅為61.3%。其原因可能在于壓熱處理下米糠蛋白聚集體的形成使泡沫液膜變脆弱，液膜對泡沫的包裹效果減弱，進而降低了蛋白質(zhì)的泡沫穩(wěn)定性；另外，研究表明柔韌性與分子間附著力之間的平衡對于產(chǎn)生穩(wěn)定的泡沫非常關(guān)鍵，由于壓熱處理造成了米糠蛋白變性，內(nèi)部疏水性基團的暴露增加了蛋白質(zhì)分子的電荷量，靜電荷產(chǎn)生的靜電作用會阻礙蛋白質(zhì)分子吸附于泡沫表面，進而造成了泡沫穩(wěn)定性的降低[10]。

2.4 表面疏水性

由圖6 壓熱處理對米糠蛋白表面疏水性的影響可知，原始米糠蛋白表面疏水值為125.32，而壓熱處理后米糠蛋白的表面疏水性有所增大，在壓熱處理20 min 后表面疏水值可達197.65，相比于原始米糠蛋白提高了近57.71%，主要的原因是因為包埋于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性氨基酸趨于“暴露態(tài)”，使米糠蛋白表面疏水性增加。

圖6 壓熱處理對米糠蛋白表面疏水性的影響Fig.6 Effects of heating with high pressure to surface hydrophobicity of rice bran protein

另外米糠蛋白隨著壓熱處理時間呈現(xiàn)先增大后降低的變化趨勢，隨著加熱時間的延長，其疏水性又開始緩慢下降，在壓熱處理30 min 下為162.30，這很可能是亞基之間的聚合形成可溶或不可溶的聚集體導(dǎo)致[11]。米糠蛋白疏水性的變化趨勢也進一步印證了關(guān)于米糠蛋白乳化性、起泡性的研究結(jié)論。

3 結(jié)論

（1）壓熱處理可有效地提高米糠蛋白溶解性，并隨著壓熱處理時間的延長，米糠蛋白溶解性呈現(xiàn)先增大后降低的變化趨勢，壓熱處理20 min 時，米糠蛋白溶解性最高，溶解度可達51.36%。米糠蛋白在長時壓熱處理后溶解性的降低主要與部分不溶性蛋白聚集體形成有關(guān)。

（2）原始米糠蛋白的乳化性約為35.6 m2·g-1，壓熱處理有效地提高米糠蛋白乳化性，并且隨著壓熱處理時間的增長呈先增大后降低的趨勢，在20 min壓熱處理后米糠蛋白的乳化性為48.3 m2·g-1。但長時壓熱處理下米糠蛋白的乳化性則降低至42.6 m2·g-1，但仍較高于原始米糠蛋白。壓熱處理后米糠蛋白乳化穩(wěn)定性有所降低，隨著壓熱處理時間的增長，米糠蛋白乳化穩(wěn)定性逐漸降低。

（3）未經(jīng)處理的米糠蛋白泡沫膨脹率為68.3%，而壓熱處理后米糠蛋白的起泡性有所提高，并總體隨時間的延長呈先增大后降低的變化趨勢，在壓熱處理25 min 時起泡性最大，此時米糠蛋白的泡沫膨脹率為159.4%。壓熱處理不利于米糠蛋白的泡沫穩(wěn)定性的維持，原始米糠蛋白的泡沫穩(wěn)定性為69.1%，而壓熱處理30 min 后米糠蛋白的泡沫穩(wěn)定性僅為61.3%。

（4）原始米糠蛋白表面疏水值為125.32，而壓熱處理后米糠蛋白的表面疏水性有所增大，隨著壓熱處理時間呈現(xiàn)先增大后降低的變化趨勢，在壓熱處理20 min 后表面疏水值最高，可達197.65。

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