黃芩提取物對(duì)常見(jiàn)致病菌的體內(nèi)外抑菌活性測(cè)定

崔一喆，耿仁德，王秋菊，朱雙，王新，孫蕊

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)墾建三江分局勤得利農(nóng)場(chǎng)第六管理區(qū)）

黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根，在我國(guó)藥用歷史悠久，迄今已有2 000 多年的歷史。黃芩中主要的黃酮類(lèi)成分為黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素，黃芩苷和漢黃芩苷及其代謝物是黃芩發(fā)揮藥用功效的物質(zhì)基礎(chǔ)[1-2]。黃芩抗菌范圍較廣，其中對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的抑制作用最強(qiáng)，且對(duì)鉤端螺旋體也有一定的抑制作用。黃芩煎劑、水浸出液對(duì)甲型流感病毒PR8 株以及亞洲甲型均有抑制作用。國(guó)內(nèi)學(xué)者在探討多種中藥對(duì)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的敏感性研究中，認(rèn)為黃芩抑菌效果最好[3]。研究采用體外抑菌試驗(yàn)確定黃芩提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌濃度，以小鼠為試驗(yàn)對(duì)象，灌注致病菌感染后，再灌注黃芩提取物，確定黃芩提取物的體內(nèi)抑菌活性，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明純種小白鼠，6～8 周齡雄鼠，體重18～23 g，購(gòu)于本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。金黃色葡萄球菌（CMCC26003），大腸桿菌（CMCC44102）、沙門(mén)氏菌（CMCC（B）50094）標(biāo)準(zhǔn)菌株由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室饋贈(zèng)。

1.2 藥品和試劑

黃芩水煎劑：將生藥常規(guī)煎煮3 次，取濾液濃縮成1 kg·L-1藥液。滅菌的酵母粉水溶液，用于稀釋腸內(nèi)容物。

1.3 培養(yǎng)基

伊紅美蘭培養(yǎng)基用于鑒別大腸桿菌，在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中加入高濃度的鹽水，用于鑒別金黃色葡萄球菌；采用沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基鑒別沙門(mén)氏菌。以上培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博生物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

采用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)菌活化，用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法將菌液稀釋至濁度為1×107CFU·mL-1，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 體外抑菌試驗(yàn)

采用試管二倍稀釋法測(cè)定黃芩提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌的最小抑菌濃度（MIC）。取滅菌試管10 支，編號(hào)，于各管中各加入無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基2 mL，然后于第1 管中加入受試藥液2 mL，混勻后取出2 mL 加入第2 管中，以此類(lèi)推，直到第9 管中取出2 mL 棄去；第10 管為肉湯對(duì)照，只加入2 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯，不加藥液；然后各管加入稀釋到2×106CFU·mL-1的菌液0.1 mL，搖勻，置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h 觀察結(jié)果，以不發(fā)生渾濁顯現(xiàn)的最高稀釋倍數(shù)為該藥物的MIC 值。

1.4.3 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)

小鼠隨機(jī)分為6 組，每組20 只，共120 只。3 組給藥組，小鼠分別灌注金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌，菌液濃度為1×107CFU·mL-1，每只小鼠灌胃0.2 mL，連續(xù)3 天，然后再灌胃1 g·mL-1黃芩水煎劑，0.2 mL·d-1，連續(xù)4 d；3 組對(duì)照組，小鼠分別灌注3 種致病菌3 d 后，灌胃與藥液相同體積的生理鹽水4 d。同時(shí)觀察7 d 內(nèi)小鼠死亡情況。

1.4.4 標(biāo)本的采集與培養(yǎng)

各致病菌灌注3 d 后和黃芩灌注4 d 后，分別從各組取5 只小鼠，無(wú)菌稱(chēng)取十二指腸、空腸、回腸和盲腸，并將同組小鼠的相同小腸內(nèi)容物混合均勻，各取0.1 g 于EP 管中，以10 倍稀釋成系列稀釋濃度。用微量移液器取各樣品的各稀釋度100 μL 接種伊紅美蘭培養(yǎng)基、高鹽培養(yǎng)基和沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基的瓊脂平板上，涂布均勻，于37 ℃需氧培養(yǎng)24 h，觀察并記錄菌落數(shù)CFU·g-1。計(jì)算公式：CFU·g-1=x·47×稀釋倍數(shù)。結(jié)果以每g 內(nèi)容物中菌數(shù)的對(duì)數(shù)表示（log CFU·g-1）[4]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

兩組間均數(shù)的比較采用t 檢驗(yàn)，用SPSS16.1 軟件統(tǒng)計(jì)分析P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 黃芩對(duì)3 種致病菌的體外抑菌性測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。從表1 中可知黃芩對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌均有抑菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強(qiáng)，MIC 值為0.031 g·mL-1，對(duì)大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的抑菌活性次之，MIC 值均為0.063 g·mL-1。

表1 黃芩提取物體外抑菌效果（MIC）Table 1 Antibacterial effects of scutellaria baicalensis in vivo（MIC）

2.2 各組小鼠死亡率測(cè)定

各組小鼠死亡數(shù)量和死亡率結(jié)果如表2 所示，給藥組與對(duì)照組相比，死亡率明顯降低。各組小鼠在灌注金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的3 d中，自第2 d 開(kāi)始有小鼠死亡，3 d 結(jié)束時(shí)各組死亡小鼠數(shù)量為2～3 只，死亡率為20%～30%；第4 d 開(kāi)始，給藥組灌注黃芩提取物，對(duì)照組灌注相同劑量的生理鹽水，結(jié)果顯示給藥各組的小鼠在大腸桿菌和沙門(mén)氏菌致病組有1 只死亡，而金黃色葡萄球菌致病組沒(méi)有死亡小鼠。整個(gè)試驗(yàn)期來(lái)看，各致病菌灌注后小鼠死亡數(shù)量沒(méi)有太大差異，而后期灌注黃芩提取物與灌注生理鹽水相比，可以顯著降低各組小鼠的死亡率。沙門(mén)氏菌致病后灌藥小鼠死亡率降低最多，達(dá)35%；大腸桿菌灌胃小鼠死亡率降低次之，為26.1%；金黃色葡萄球菌灌胃小鼠死亡率降低最少，為15%。但就灌菌后與灌水組相比，黃芩灌胃使金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌致病組小鼠的死亡數(shù)量由2只降為0 和由3 只降為1，顯著降低這兩組小鼠的死亡率。而灌藥后大腸桿菌致病組的小鼠死亡數(shù)量減少1 只，與灌水組死亡數(shù)量的2 只相比，死亡數(shù)量減少50%，也有顯著抑菌作用。

表2 各組小鼠死亡數(shù)量Table 2 Animal death rate of antibacterial test in mice

2.3 黃芩對(duì)3 種致病菌的體內(nèi)抑菌性測(cè)定

給藥組和對(duì)照組小鼠十二指腸、空腸、回腸和盲腸中3 種致病菌菌數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3 可見(jiàn)，與各對(duì)照組相比，各給藥組的各段小腸中各致病菌數(shù)量均有降低，且大腸桿菌和沙門(mén)氏菌的數(shù)量在給藥后顯著降低（P＜0.05），而金黃色葡萄球菌數(shù)量在給藥后極顯著降低（P＜0.01）；可見(jiàn)黃芩提取物對(duì)小鼠體內(nèi)的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌均具有明顯的抑制作用。通過(guò)計(jì)算給藥組對(duì)各組小鼠各段腸道中各致病菌的抑菌率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芩提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率最高，平均達(dá)到53%以上的抑菌率；對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌率次之，平均抑菌率達(dá)到36%以上；對(duì)大腸桿菌的抑菌率最低，平均為32%，且各個(gè)腸斷抑菌效果差異性較大。

表3 各組小鼠各小腸段中細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果（logCFU·g-1）Table 3 Results of bacteria in small intestine of mice

3 討論

黃芩為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，文獻(xiàn)資料顯示，黃芩可用于治療腸炎、痢疾等疾病。黃芩抗菌譜廣，其煎劑對(duì)多種革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌及螺旋體等的生長(zhǎng)均有抑制作用[5]。黃芩也具有抗真菌活性，對(duì)白色念珠菌、許蘭毛癬菌等多種致病性真菌的生長(zhǎng)有一定抑制作用[6-8]。研究證明，黃芩具有較強(qiáng)的抗菌作用，可能是抑制了ATP 合成酶[9]。這些也證明了，試驗(yàn)中黃芩提取物降低小鼠死亡率的原因。

目前中藥體外抑菌方面的實(shí)驗(yàn)主要是采用試管二倍稀釋法[1]，但在試驗(yàn)過(guò)程會(huì)受培養(yǎng)基、細(xì)菌接種量等方面的影響。但單純的體外試驗(yàn)并不能真實(shí)地反映中藥的抑菌效果，因?yàn)樵讷F醫(yī)臨床應(yīng)用中，中藥發(fā)揮作用是藥物、細(xì)菌和機(jī)體三者間互相作用的結(jié)果。試驗(yàn)通過(guò)黃芩提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌體內(nèi)外的抑菌效果，希望能對(duì)以后的研究提供一些參考。為畜禽疾病的防治提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

通過(guò)研究得出，黃芩提取物對(duì)常見(jiàn)的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌等致病菌具有較明顯的體內(nèi)外抑菌作用。

［1］辛文妤，宋俊科，何國(guó)榮，等.黃芩素和黃芩苷的藥理作用及機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國(guó)新藥雜志，2013，22（6）：647-653.

［2］滕占才，王波，梁英.黃芩中黃芩苷常規(guī)回流浸提工藝優(yōu)化研究［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，25（1）：70-73.

［3］欒耀芳，張鳳花，吳國(guó)英，等.黃芩8 種中藥對(duì)產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的敏感性研究［J］.山東中醫(yī)雜志，2005，24（10）：629-631.

［4］楊景云.醫(yī)用微生態(tài)學(xué)［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1997.

［5］周立剛，張穎君，蔡艷，等.黃酮和甾體類(lèi)化合物的抗真菌活性［J］.天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，1997，9（3）：24 -29.

［6］張喜平，李宗芳，劉效恭.黃芩素的藥理學(xué)研究概況［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2001，17（6）：711-713.

［7］Dai B，Cao Y，Huang S，et al.Baicalein induces programmed cell death in Candida albicans ［J］.J Microbiol Biotechnol，2009，19（8）：803-809.

［8］楊得坡，胡海燕.黃芩甙元和黃芩甙對(duì)皮膚真菌與細(xì)菌抑制作用的研究［J］.中藥材，2000，23（5）：272 -274.

［9］Chinnam N，Dadi P，Sabri S，et al.Dietary bioflavonoids inhibit Escherichia coli ATP synthase in a differential manner［J］.Int J Biol Macromol，2010，46（5）：478-486.

［10］潘翠翠，郭永霞，王麗艷，等.甘草提取物對(duì)5 種植物病原菌的抑菌作用［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，26（3）：1-4.