SPE-HPLC測定土霉素菌渣中土霉素的殘留效價

牛紀(jì)娥，葉暾旻，王 璞，劉惠玲

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院城市水資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150090)

土霉素是由龜裂鏈霉菌產(chǎn)生的一種廣譜類抗生素，是臨床上重要的天然產(chǎn)物和其半合成衍生物，對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和原生動物起作用，通過與30S核糖體亞基結(jié)合來阻止蛋白質(zhì)的合成.我國是土霉素生產(chǎn)、使用和銷售大國，2003年我國土霉素產(chǎn)量達(dá)到了1萬t，占世界總產(chǎn)量的一半以上[1]，并且每年都在成上升趨勢，2009年產(chǎn)量占世界的90%[2]，按生產(chǎn)1 t土霉素產(chǎn)生40 t濕菌渣，則2003年年產(chǎn)40萬t菌渣，過去人們一直把土霉素菌渣曬干作為飼料添加劑，由于菌渣中殘留的少量抗生素及其降解產(chǎn)物可能會在動物體內(nèi)富集，進(jìn)而可影響到人類本身產(chǎn)生耐藥性，因而使菌渣用作動物飼料的可能性遭到質(zhì)疑，2002年農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布第176號公告，把抗生素列入禁止在飼料和動物引用水中使用藥物品種名錄中，2008年把未經(jīng)過處理的抗生素發(fā)酵菌渣納入“危廢”范圍.要實(shí)現(xiàn)土霉素菌渣的無害化、減量化、資源化，其中土霉素殘留的檢測分析技術(shù)是重要控制因子.

不同基質(zhì)中土霉素的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫分析法[3]、微生物法[4]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[5]、高效液相色譜法[6]等，微生物法雖然操作簡單，但是靈敏度低、易干擾;免疫分析法穩(wěn)定性差;液質(zhì)雖然靈敏度高但是價格昂貴，前處理復(fù)雜，不易普及;液相高效、快速、靈敏度高;由于菌渣中土霉素殘留量少，基質(zhì)復(fù)雜，則本文選用高效液相色譜法既可以滿足檢測限，也可以廣泛普及.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

LC-10A型高效液相色譜儀，LG-16B型離心機(jī)，SB-5200 DTD超聲波清洗機(jī)，QL-866振蕩器，數(shù)字PH計，UC-2550紫外分光光度計，RE52-4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，HSE-12B型固相萃取儀，容聲冰箱，HN200多功能氮吹儀.

土霉素(純度≥98%)購于阿拉丁;甲醇、乙腈均為色譜純;磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、草酸為分析純;試驗(yàn)用水為超純水.

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品配制

土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取0.500 g土霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至50 mL，得到質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于冰箱中避光保存(在-18℃下可保存1月).

1.3 色譜條件

色譜柱:Agilent TC-C18柱，(4.6 × 250 mm，填料粒徑5.0 μm);流動相:乙腈:0.02 mol/L磷酸二氫鈉緩沖溶液(pH=2.5，1 L溶液含0.48 gNa2EDTA)25∶75(V∶V);流速:1.0 mL/min;檢測波長:354 nm;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:30 °C.

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1.0 g土霉素菌渣于50 mL聚四氟乙烯離心管中，加入5 mL甲醇，4 mL冰乙酸和2 mL 0.5 mol/L的氯化鈉，震蕩混勻1 min，靜置30 min，超聲萃取30 min，以4 000 r/min的速度離心10 min后靜置分層，在30°C對上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，對其剩余的溶液定容至5 mL.

依次用5 mL甲醇、5 mL超純水、5 mL 2g/L Na2EDTA活化Waters Sep-Pak C18固相萃取小柱，將提取液過柱，用5 mL超純水清洗小柱，再用3 mL 0.01 mol/L草酸甲醇溶液洗脫土霉素，收集洗脫液，40℃條件下高純氮?dú)獯抵两?，用流動相定容? mL，過濾至樣品瓶待測.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長

土霉素屬于氫化并四苯環(huán)衍生物，在354 nm左右有較強(qiáng)的紫外吸收[7]，本實(shí)驗(yàn)利用紫外分光光度計對土霉素標(biāo)準(zhǔn)品在200～600 nm之間進(jìn)行波長掃描，如圖1，由圖1知在270 nm和354 nm有最大吸收波長，經(jīng)實(shí)際實(shí)驗(yàn)知土霉素在270 nm檢測基線干擾嚴(yán)重，因此，本文選擇354 nm作為土霉素的檢測波長.

圖1 土霉素的波長掃描圖

2.1.2 流動相的選擇

對于有機(jī)溶劑一般選擇甲醇和乙腈，乙腈有較低的吸光度和較強(qiáng)的洗脫能力[8]，在相同條件下對其實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，甲醇不能使土霉素的峰完全分離，乙腈則出現(xiàn)尖銳的單峰，選擇乙腈作為有機(jī)相[9-12]，本實(shí)驗(yàn)考察了常用的無機(jī)相磷酸二氫鈉、乙酸、草酸，結(jié)果乙酸和草酸色譜圖出現(xiàn)兩個峰，不能使其分離，最后選用磷酸二氫鈉.

土霉素的結(jié)構(gòu)含有多種官能團(tuán)，能夠與金屬離子螯合，螯合物易于色譜柱的硅醇基結(jié)合導(dǎo)致出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，則在流動相中添加Na2EDTA使其螯合發(fā)生在色譜柱分離之前[13]，這種在色譜柱上衍生的方法通常是快速的，但這對流動相的pH要求很嚴(yán)，同時由于土霉素屬于兩性物質(zhì)，則在不同pH值條件下存在的形式不同，靈敏度也不同，色譜柱承受的pH值范圍是2～7，本文考察了pH值在2.5～6.5范圍內(nèi)對土霉素分離效果的影響，結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，pH值越低，分析速度越快，靈敏度越好，則選擇pH=2.5.

2.1.3 流動相比例

土霉素菌渣中含有蛋白質(zhì)、脂肪、色素的物質(zhì)，其中一些物質(zhì)與土霉素具有相似的光譜吸收特征，則需要調(diào)節(jié)流動相比例，進(jìn)而調(diào)節(jié)土霉素的出峰時間，使其峰與雜峰分開.水峰一般在3 min左右出現(xiàn)，對于C18柱，極性越強(qiáng)的物質(zhì)出峰時間越早，土霉素隨著乙腈比例的增加，出峰時間越長，調(diào)節(jié)乙腈與磷酸二氫鈉的配比使土霉素峰與雜峰在較短時間內(nèi)有效分離，一般控制出峰時間在3 min之后，對其不同比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)峰性、峰高、靈敏度和出峰時間選擇流動相比例為25∶75.

通過以上色譜條件下的土霉素的液相色譜圖見圖2.

圖2 土霉素標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖

2.2 固相萃取條件優(yōu)化

2.2.1 提取液的選擇

關(guān)于土霉素菌渣中提取土霉素的文獻(xiàn)國內(nèi)外很少，參考土霉素在其他基質(zhì)[14-17]中的提取方法，選擇甲醇、甲醇/水、McIlvaine-Na2EDTA、甲醇/冰乙酸/0.5mol/LNaCl(V/V/V=5/4/2)，作為提取液，這四種提取液對土霉素菌渣做添加回收率試驗(yàn)，結(jié)果見圖3，結(jié)果表明，甲醇/冰乙酸/0.5 mol/L NaCl對土霉素的回收率最高，因?yàn)橥撩顾貙儆谒釅A兩性化合物，其極性結(jié)構(gòu)決定其可溶于含有機(jī)溶劑的冰醋酸，則本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇/冰乙酸/0.5 mol/L NaCl作為提取液.

對于其他三種提取液的分析，只用甲醇作為提取劑效果比較好，但穩(wěn)定性較差，濃縮時間太長，不能直接通過固相萃取柱凈化，操作比較復(fù)雜，容易產(chǎn)生人為誤差;甲醇/水做提取劑缺點(diǎn)是提取量少，很多目標(biāo)物沒有被提取出來;McIlvaine-Na2EDTA是提取土霉素最常用的提取劑，但是在菌渣中不太適合，回收率不高.

圖3 不同提取液對回收率的影響

2.2.2 固相萃取柱的選擇

土霉素菌渣屬于發(fā)酵產(chǎn)物，則其基質(zhì)比較復(fù)雜，對其凈化處理尤為重要，對于離子交換萃取柱需要溶液的pH值變化，能夠引起土霉素不可逆的異構(gòu)化和脫水[18-19]，因此本實(shí)驗(yàn)選用LC-C18，Poly-Sery HLB，Waters Sep-Pak C18固相萃取柱進(jìn)行對比，加標(biāo)回收試驗(yàn)見圖4，則選擇因?yàn)閃aters Sep-Pak C18的回收率高、且重現(xiàn)性好.則選擇Waters Sep-Pak C18.

圖4 不同固相萃取柱對回收率的影響

2.2.3 活化劑的選擇

活化劑的作用是使填料的表面完全侵潤，確保填料所有的表面積都可與分析物作用，提高實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn).對于抗生素實(shí)驗(yàn)常用的是甲醇和水，由于土霉素的結(jié)構(gòu)易與于金屬螯合，Na2EDTA在流動相中的重要作用已經(jīng)提過，同樣為了提高土霉素的回收率和提取量，則需要在活化劑中添加Na2EDTA，對比實(shí)驗(yàn)見圖5，由圖知活化劑中需添加Na2EDTA，避免土霉素吸附在柱子上.

圖5 不同活化劑對回收率的影響

2.2.4 洗脫液的選擇

土霉素屬于極性物質(zhì)，根據(jù)相似相容原理，洗脫液要有一定的極性，既要將目標(biāo)物盡可能的完全洗脫下來，又要避免洗出干擾雜質(zhì).本文比較了甲醇、0.01 mol/L草酸甲醇、甲醇/乙酸乙酯(1/1)，加標(biāo)回收試驗(yàn)見圖6，由圖6知0.01 mol/L草酸甲醇的洗脫效果最好，純甲醇的洗脫的峰性太大，并且有拖尾，因?yàn)榧兗状嫉臉O性強(qiáng)，則洗脫性太強(qiáng)，在完全洗脫目標(biāo)物的同時，洗脫出一些干擾物質(zhì).

圖6 不同洗脫液對回收率的影響

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將土霉素的標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為0.01～1 000 mg/L，按照前述的色譜條件進(jìn)行檢測.以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，土霉素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限(表1).結(jié)果表明，土霉素在0.01～1 000 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性.

表1 土霉素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)和精密度

稱取1.0 g菌渣，添加不同量的土霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，按1.4的步驟對加標(biāo)樣品進(jìn)行前處理，按1.3的色譜條件進(jìn)行樣品檢測，每個樣品的每個加標(biāo)量平行測定6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

表2 土霉素的回收率與精密度(n=6)

2.5 實(shí)際樣品檢測

對河北某制藥廠采取的土霉素菌渣樣品進(jìn)行抽樣，按照本方法進(jìn)行處理和檢測，結(jié)果表明，土霉素質(zhì)量比在4.5～5.2 mg/g.說明土霉素菌渣中含有大量的土霉素，在進(jìn)行資源化之前要進(jìn)行脫毒處理.

3 結(jié)語

本文通過建立固相萃取-高效液相色譜法來檢測土霉素菌渣中土霉素的殘留效價，對樣品預(yù)處理過程和液相色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化.三個添加水平下的回收率可達(dá)89.2% ～97.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6% ～2.4%(n=6).結(jié)果表明，該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，可用于土霉素菌渣中土霉素殘留效價的檢測，為土霉素菌渣資源化方法的實(shí)施提供了技術(shù)支持.

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