不同產(chǎn)地龍葵藥材的高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測指紋圖譜

王 玨， 金一寶， 王鐵杰， 李曉帆

（1.深圳市藥品檢驗(yàn)所，深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳518057；2.深圳大學(xué)，深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518060）

龍葵是茄科植物龍葵Solanum nigrum L.的干燥地上部分［1］。其性寒、味苦、微甘、有小毒，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、活血化瘀、利水消腫、止咳祛痰的功效［2］?，F(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)上廣泛用于感冒、牙痛、皮膚瘙癢癥、慢性支氣管炎、急性腎炎等炎癥治療［3-5］。近期研究發(fā)現(xiàn)龍葵具有很好的抗腫瘤活性［6］，國內(nèi)外學(xué)者的研究報(bào)道主要集中在皂苷類成分［7］和甾體生物堿類成分［8］等具有抗腫瘤活性的物質(zhì)。龍葵藥材生長范圍極其廣泛，采集來源基本涵蓋我國大部分產(chǎn)區(qū)［9］，不同地區(qū)的種質(zhì)藥用成分含量差別很大。WHO《草藥評價(jià)原則》［10］以及FDA《植物藥研制指南》［11］均提出植物藥療效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是藥物的整體成分，任何一種或幾種活性成分均不能代表藥物的整體。在植物藥制品的臨床前研究資料中，利用指紋圖譜等分析方法來評價(jià)植物藥品的一致性和穩(wěn)定性［12］。中藥色譜指紋圖譜能較好地體現(xiàn)中藥成分的復(fù)雜性和相關(guān)性，因此本文對不同產(chǎn)地來源的龍葵藥材進(jìn)行了指紋圖譜研究，獲得了在蒸發(fā)光散射檢測器下非揮發(fā)性成分的指紋圖譜。結(jié)果顯示，不同來源的龍葵之間有顯著的差異性，利用其指紋圖譜可以很好地實(shí)現(xiàn)分類。該研究可作為龍葵藥材的參照指紋圖譜，從而進(jìn)一步完善龍葵藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥材

不同產(chǎn)地的龍葵藥材共34批，具體采集地點(diǎn)見表1。龍葵藥材由沈陽藥科大學(xué)吳維春老師鑒定均為Solanum nigrum L.的干燥地上部分。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀（日本島津株式會(huì)社，SEDEX MODEL 75，二元梯度泵LC-10ATVP），色譜柱選用Phenomenex C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）。色譜級(jí)甲醇（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），色譜級(jí)乙腈（迪馬公司），色譜級(jí)三乙胺（Fisher Scientific），蒸餾水，無水乙醇（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 色譜條件

Phenomenex C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm），流速 1.0 mL／min，流動(dòng)相 A 相為乙腈（含0.03% （v／v）三乙胺），B 相為20% （v／v）甲醇水溶液（含0.03% （v／v）三乙胺），二元線性梯度洗脫（洗脫程序：0～10 min，A相由10%升至15%；10～15 min，A相由15%升至30%；15～30 min，A相由30%升至34%；30～52 min，A相由34%升至50%；52～55 min，A相由50%升至55%），柱溫25℃，蒸發(fā)光檢測器蒸發(fā)管溫度40℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.4 樣品制備

1.4.1 供試品溶液的制備

取干燥的龍葵藥材，粉碎后過2號(hào)篩，再真空干燥12 h，取藥材粉末2份，每份2.0 g，精密稱定。加60% （v／v，下同）乙醇水溶液20 mL，超聲提取2次，每次20 min。過濾，合并濾液，濾液減壓濃縮至近干，用60%乙醇水溶液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加60%乙醇水溶液定容，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

表1 龍葵藥材產(chǎn)地及采集時(shí)間Table 1 Sources and collection times of Solanum nigrum L.raw herbs

1.4.2 對照品溶液

分別稱取適量前期研究中分離得到的12個(gè)對照品［13］（結(jié)構(gòu)式見圖1），精密稱定，加60% 乙醇溶解制成一定濃度的對照品溶液，用于色譜峰的歸屬。

圖1 對照品的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of standard samples

圖1 （續(xù)）Fig.1 （Continued）

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件考察

2.1.1 色譜柱

在同樣的流動(dòng)相條件下，用3種不同品牌的色譜柱分別分析同一個(gè)樣品。通過色譜圖的比對發(fā)現(xiàn)UltimateTM和SHIMADZU柱的分離效果明顯不及Phenomenex柱（見圖2）。由此本試驗(yàn)選擇Phenomenex C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）柱。

2.1.2 流動(dòng)相洗脫程序

考察了不同的流動(dòng)相系統(tǒng)，主要有乙腈-水（等度）、乙腈-水（梯度）、乙腈-水（均含0.03% 三乙胺，梯度）以及乙腈-甲醇-水（均含0.03%三乙胺，梯度）。結(jié)果表明：使用含0.03%（v／v）三乙胺的乙腈-20%（v／v）甲醇水溶液系統(tǒng)，二元線性梯度洗脫，各成分峰形尖銳，分離度良好，各主要成分洗脫完全，適合用于藥材色譜指紋圖譜的建立。

2.1.3 蒸發(fā)光散射檢測器

蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light-scattering detector，ELSD）是通用型檢測器，可檢測非揮發(fā)性有機(jī)物，如皂苷［14］、糖苷［15］等成分。其檢測步驟包括霧化、蒸發(fā)和激光檢測［16］。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蒸發(fā)管溫度的設(shè)定對分析影響較大，當(dāng)蒸發(fā)管溫度設(shè)定為高于80℃時(shí)，會(huì)導(dǎo)致相關(guān)色譜峰的消失（見圖3）。而溫度設(shè)定為40℃此峰保留，且其他因素對試驗(yàn)的影響不大。

圖2 不同色譜柱分離所得的色譜圖Fig.2 Chromatograms from different columns

圖3 不同檢測溫度下的色譜圖Fig.3 Chromatograms at different temperatures of evaporation

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn)

取同一批次的龍葵藥材粉末1份，按1.4.1節(jié)方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次。將測得的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012.1版本）”進(jìn)行比較。5次試驗(yàn)之間的相似度均大于0.95，相對峰面積RSD均小于3.0%，表明精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的龍葵樣品粉末5份，以1.4.1節(jié)方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣測定。將測得的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012.1版本）”進(jìn)行比較。5次試驗(yàn)之間的相似度均大于0.95，相對峰面積RSD均小于3.0%，由以上試驗(yàn)可知重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批次的龍葵藥材粉末，制備供試品溶液，分別在制備后 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h、2 d、15 d時(shí)間段進(jìn)樣，進(jìn)行測定。將測得的色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012.1版本）”進(jìn)行比較，8次實(shí)驗(yàn)相似度大于0.95，相對峰面積RSD均小于3.0%，由以上試驗(yàn)結(jié)果可知，樣品在15 d內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.3 指紋圖譜研究

取41批來自各個(gè)產(chǎn)地的藥材，分別按1.4.1節(jié)方法制備供試品溶液，按1.3節(jié)的色譜條件分別進(jìn)樣，記錄各批藥材的色譜圖。通過提取各色譜圖，導(dǎo)入至“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2012.1版本）”，進(jìn)行相似度計(jì)算（見表2），并建立指紋圖譜進(jìn)行比較。

經(jīng)過相似度軟件處理可以看出不同產(chǎn)地的龍葵藥材之間化學(xué)成分存在較大的差異，根據(jù)它們的相似度值，將收集到的34批龍葵藥材可分為3類：第一類：藥材色譜圖的相似度小于0.5，包括：S24、S28、S30和S31，藥材產(chǎn)地分別為上海、廣東深圳、廣西桂林以及黑龍江鶴崗。這類藥材的各成分含量明顯有別于其他產(chǎn)地的藥材（見圖4a），故不適于應(yīng)用于建立該藥材的指紋圖譜，應(yīng)予剔除。第二類：此類藥材的相似度在0.5～0.9之間，包括：S9、S13、S17、S18、S19、S20、S22、S23 和 S29，來自河北唐山、安徽黃山、山東德州、湖南郴州、遼寧大連、新疆烏魯木齊、海南海口、內(nèi)蒙古赤峰和浙江杭州，由于相似度略低，也不宜采用（見圖4b）。第三類：為大部分地區(qū)產(chǎn)龍葵藥材，這部分藥材的色譜圖基本相似，相似度在0.9～1.0之間。此類藥材的產(chǎn)地為遼寧海城、山東泰安、吉林長春、北京順義、河北石家莊、吉林農(nóng)安、河南平頂山、內(nèi)蒙古通遼、河北唐山、河北廊坊、遼寧朝陽、天津薊縣、吉林四平、遼寧錦州、河南信陽、山東德州、沈陽東陵、沈陽北陵、內(nèi)蒙古赤峰、陜西西安、河南鄭州、山西運(yùn)城、陜西咸陽等地。從平均色譜圖中可以看出，第一類和第二類的龍葵藥材樣品中相關(guān)成分的含量過少，尤其是第一類，可能是產(chǎn)地或氣候等因素造成它們與另兩類藥材的差別特別大。因此，在實(shí)際生產(chǎn)使用中，第一類和第二類藥材不太適用，所以根據(jù)實(shí)際應(yīng)用的需要，優(yōu)選了第三類的藥材，以這類穩(wěn)定性、均一性都比較好的藥材建立指紋圖譜。第三類藥材的相似度比較接近，說明相關(guān)產(chǎn)地的龍葵藥材質(zhì)量有較好的相似性，并且其產(chǎn)地包括了龍葵藥材的主要產(chǎn)區(qū)，因此，由這些藥材得到的平均指紋圖譜可以用來反映我國大部分地區(qū)龍葵藥材的特點(diǎn)，作為這些地區(qū)龍葵藥材的指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)（見圖4c）。

表2 34批藥材的色譜圖相似度Table 2 Similarities of the chromatograms of 34 samples

第三類龍葵的平均指紋圖譜包含較多信息且地域涉及較廣，可以代表藥材的基本色譜特征，為藥材之間的比較提供參考依據(jù)，因此在建立參照指紋圖譜時(shí)應(yīng)將偏差較大的藥材剔除。本研究將第一、二類藥材共計(jì)13批藥材剔除，其余的21批產(chǎn)地覆蓋較廣且相似度都在0.9以上。由表2可知第三類藥材指紋圖譜的相似度高，接近共有模式，藥材來源確切，故將此類藥材的平均指紋圖譜作為龍葵藥材的參照指紋圖譜（見圖5A），并從中確定了13個(gè)共有峰（因1，2，3號(hào)峰未完全分離，故不作為共有峰）。

2.4 色譜峰指認(rèn)

取20 μL配制好的混合對照品溶液注入高效液相色譜儀，按1.3節(jié)色譜條件進(jìn)行分析檢測以獲取色譜圖（見圖5B）。將指紋圖譜中的共有峰與各對照品的保留時(shí)間相比對，確認(rèn)各峰歸屬?？纱_定4、6、7、8、9、10、11、13、14、15 和 16 號(hào)峰，分別為 tribu-luside A、5-pregn-16-en-3β-ol-20-one lycotetraoside、亞油酸、軟脂酸、油酸、澳洲茄堿、澳洲邊茄堿、β2-澳洲邊茄堿、nigrumnin I、去半乳糖替告皂甙以及 macrostemososide A，而 1、2、3、5 及 12 號(hào)峰尚未能指認(rèn)。

圖4 3類龍葵藥材擬合所得平均色譜圖Fig.4 Average chromatograms obtained by fitting the chromatograms of three kinds of Solanum nigrum L.samples

圖5 龍葵指紋圖譜色譜峰的指認(rèn)Fig.5 Peak recognition of the fingerprints of Solanum nigrum L.

3 結(jié)論

本文利用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測開展了龍葵藥材的指紋圖譜研究，考察了34批不同來源的龍葵藥材，選取其中21批相似度大于0.9、具備廣泛代表性的藥材，建立了包含13個(gè)共有峰的參照指紋圖譜，并對其中的11個(gè)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。研究結(jié)果表明，利用高效液相色譜法結(jié)合蒸發(fā)光散射檢測得到指紋圖譜，可以鑒定與評價(jià)中藥材中的非揮發(fā)性成分。該方法可以進(jìn)一步拓展，應(yīng)用于其他中藥材中的內(nèi)源產(chǎn)物指紋圖譜庫的建立，為中藥的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性評價(jià)提供新的技術(shù)方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，還可與傳統(tǒng)的基于紫外檢測器的技術(shù)進(jìn)行相互驗(yàn)證和補(bǔ)充，為中藥提供更加準(zhǔn)確有效的分類鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

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