高效液相色譜法測定菌群降解纖維素產(chǎn)物中的糖、有機酸和醇

姜 艷， 范桂芳， 杜 然， 李佩佩，姜 立， 趙 剛， 齊泮侖， 李十中*

（1.清華大學核能與新能源技術研究院，北京100084；2.北京市生物燃料工程技術研究中心，北京100084；3.中國石油天然氣股份有限公司石油化工研究院，北京100000）

利用菌群降解木質(zhì)纖維素一步法生產(chǎn)燃料乙醇，由于操作工藝簡單且無酶水解需要的纖維素酶成本，是近年來第二代燃料乙醇生產(chǎn)發(fā)展的重要方向［1-4］。測定菌群降解纖維素發(fā)酵液中各種糖類、有機酸及乙醇代謝成分組成的變化，對揭示其代謝途徑以及控制發(fā)酵過程，進而從代謝工程角度改良菌群和優(yōu)化發(fā)酵工藝條件具有重要的意義。

傳統(tǒng)的第二代燃料乙醇生產(chǎn)技術首先將木質(zhì)纖維素預處理、酶解糖化成可發(fā)酵糖，然后經(jīng)過發(fā)酵將糖轉化為乙醇［4］。在纖維素降解產(chǎn)物分析中，Geng等［5］用毛細管電泳-電噴霧質(zhì)譜法檢測了木質(zhì)纖維素酸預處理過程中產(chǎn)生的碳水化合物和木質(zhì)素衍生物，Ibanez等［6］用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定了木質(zhì)纖維素酸預處理過程中的微量有機酸抑制物。離子色譜［7-10］和液相色譜［11，12］方法已經(jīng)成功應用于產(chǎn)物中糖和有機酸檢測；氣相色譜［13］已經(jīng)成功應用于產(chǎn)物中醇和有機酸的檢測。

然而，菌群降解纖維素發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的體系中含有糖、有機酸和醇3大類物質(zhì)以及菌群的培養(yǎng)基，我們需要對這些物質(zhì)進行具體分析來判斷能否同時檢測。培養(yǎng)基對檢測的干擾來自兩個方面，一是培養(yǎng)基中存在的鈣離子會與色譜柱說明書里推薦的稀硫酸流動相產(chǎn)生沉淀，從而堵塞色譜柱；二是培養(yǎng)基中包含的有機物也會在色譜圖里出峰。不同于化學降解法產(chǎn)物復雜［5，6］，纖維素生物降解產(chǎn)生的有機酸和醇相對簡單；杜然等［1］、Wang 等［14］和Guo等［15］用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測出菌群發(fā)酵液的主要揮發(fā)性產(chǎn)物包含乙醇、乙二醇、乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸和甘油；本文的研究體系用氣相色譜未檢測到丙酸，所以后續(xù)分析不考慮檢測丙酸。對于體系中可能存在的糖，由于本文采用的發(fā)酵底物濾紙是純纖維素，也就是葡聚糖以β-1，4糖苷鍵連接，其降解產(chǎn)物是纖維二糖和葡萄糖。綜合以上分析及色譜圖結果，本文確定纖維二糖、葡萄糖、乙醇、丁醇、甘油、乙酸與丁酸7種組分為代謝產(chǎn)物，并采用加酸除鈣和調(diào)節(jié)pH的樣品預處理方法，在HPLC儀器上利用Bio-Rad Aminex HPX-87H糖分析柱分離，利用示差折光檢測器（RID）檢測，建立了同時測定這7種組分的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

島津SHIMADZU液相色譜儀LC-20A（配島津化學工作站）；HERMLE Z216MK高速冷凍離心機（德國HERMLE公司）；Cascada IX超純水設備（美國 PALL公司）。乙醇（純度為 99.5%，美國MREDA公司）、丁醇（純度為99.5%，北京化工廠）、甘油（純度為99.5%，美國Amresco公司）、葡萄糖（純度為99.5%，美國Sigma公司）、纖維二糖（純度為99.0%，美國 Sigma公司）、乙酸（純度為99.5%，北京化工廠）、丁酸（純度為99.0%，北京化工廠）。硫酸（純度為99.5%，北京化工廠）、乙酸乙酯（純度為 99.9% ，美國 Sigma）。

1.2 實驗條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Bio-Rad Aminex HPX-87H（300 mm ×7.8 mm）；流動相：0.005 mol／L H2SO4；流速：0.5 mL／min；進樣量：20 μL；柱溫：60 ℃；檢測器：RID。

1.2.2 樣品預處理

取5 mL發(fā)酵液，稀釋適當倍數(shù)，加入硫酸調(diào)節(jié)pH=3以防止有機酸離解并使鈣離子沉淀，離心（10 000 r／min，3 min）。上清液用 0.22 μm 水系膜過濾后進樣。

1.2.3 定性與定量

在相同的條件下，將樣品色譜圖與標準品色譜圖對照，根據(jù)保留時間確定樣品中各組分的色譜峰；在標準品與樣品進樣量相同的情況下，應用外標法定量，計算樣品中各組分的含量。

2 結果與討論

2.1 線性關系及檢出限

精確稱取纖維二糖、葡萄糖、甘油、乙酸、丁酸、乙醇、丁醇標準品，用超純水溶解配制成標準溶液，各標準溶液的質(zhì)量濃度分別為 0.020、0.040、0.080、0.100、0.200、0.400、0.800 和 1.000 g／L。以峰面積y對質(zhì)量濃度x（g／L）進行線性回歸，各標準品的線性回歸方程、線性范圍、線性相關系數(shù)見表1。對標準溶液進行稀釋，取S／N=3時組分的濃度為檢出限，結果見表1。

表1 化合物的保留時間、線性關系和檢出限（S／N＝3）Table 1 Retention times，linear relationships and limits of detection （LODs，S／N ＝3）of the compounds

2.2 組分的確定

在1.2.1節(jié)色譜條件下分別檢測待測糖、醇和有機酸的單標準溶液，確定各組分的保留時間；相同條件下分別測定待測組分的混合標準溶液、實際樣品和培養(yǎng)基溶液，結果見圖1。從圖1可以看出，各組分能有效分離，出峰順序為纖維二糖、葡萄糖、丁醇、甘油、乙酸、丁酸和乙醇。

圖1 （a）標準溶液、（b）樣品和（c）培養(yǎng)基溶液的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of（a）standard solution，（b）sample and （c）cell culture solution

為了輔助定性幾種有機酸和醇，樣品經(jīng)乙酸乙酯萃取，萃取液經(jīng)氣相色譜分析（Agilent 7890A氣相色譜儀，火焰光度檢測器（FID），CP-Wax-57CB色譜柱（50 m ×0.25 mm ×0.2 μm），載氣為 N2）見圖2，圖2顯示了乙酸乙酯溶劑、乙酸乙酯萃取的標準溶液和乙酸乙酯萃取的樣品的氣相色譜分離圖。由圖2可知，該菌群發(fā)酵液中的主要揮發(fā)性產(chǎn)物為乙醇、丁醇、乙酸、丁酸，未檢出丙酸。本文采取的氣相色譜汽化條件沒能使甘油汽化，故氣相色譜分析沒有檢測到甘油。

2.3 回收率與精密度

取菌群降解纖維素發(fā)酵初始液1份，添加不同水平的混合標準溶液，按1.2.2節(jié)方法處理并按1.2.1節(jié)條件測定，每一加標水平平行測定6次，計算平均回收率。由表2可見7種組分的平均加標回收率為85.41%～115.60%，RSD≤4.62%。結果表明，在不同的加標水平下，7種組分的回收率較為穩(wěn)定，精密度良好，滿足樣品分析要求。

表3為一個發(fā)酵樣品中目標組分的測定結果。由表3可見，6次測定樣品中纖維二糖、葡萄糖、甘油、乙酸、丁酸、乙醇和丁醇質(zhì)量濃度的RSD分別為3.94%、0.97%、4.54%、3.19%、3.86%、4.47% 和4.70%。

圖2 （a）溶劑、（b）標準溶液和（c）樣品的氣相色譜圖Fig.2 GC chromatograms of（a）a solvent，（b）a standard solution and （c）a sample

表2 樣品中7種組分的加標回收率及相對標準偏差（n＝6）Table 2 Recoveries and RSDs of the seven compounds spiked in the samples（n＝6）

2.4 檢測過程的干擾因素

如圖1所示，由培養(yǎng)基帶來的主要色譜峰對發(fā)酵產(chǎn)物色譜峰不形成干擾。但是保留時間在18.04 min處的小峰與產(chǎn)物乙酸的峰不能完全分離。當發(fā)酵液中乙酸的質(zhì)量濃度為1.100 g／L時，兩個峰的分離度為2.333，基本滿足色譜分離的要求。

表3 菌群發(fā)酵液分析重復性試驗結果Table 3 Repeated experiment results of microbial consortium fermentation broth g／L

3 結論

采用高效液相色譜法建立了菌群降解纖維素發(fā)酵液中多種醇、有機酸和糖類化合物的定量分析方法。該方法準確可靠，可實現(xiàn)對菌群降解纖維素發(fā)酵產(chǎn)物中纖維二糖、葡萄糖、甘油、丁醇、乙酸、丁酸和乙醇的同時快速、準確和高效分離檢測，為研究纖維素菌群代謝途徑，優(yōu)化發(fā)酵過程提供了有效手段。

［1］ Du R，Li S Z，Zhang X Q，et al.Chinese Journal of Biotechnology（杜然，李十中，章曉慶，等.生物工程學報），2010，26（7）：960

［2］ Du R，Yan J B，Li S Z，et al.Biotechnol Biofuels，2015，8：10

［3］ Brethauer S，Studer M H.Energy Environ Sci，2014，7：1446

［4］ Bhutto A W，Qureshi K，Harijan K，et al.RSC Adv，2014，4：3392

［5］ Geng X M，Zhang S F，Wang Q，et al.J Chromatogr A，2008，1192：187

［6］ Ibanez A B，Bauer S.Biotechnol Biofuels，2014，7：145

［7］ Bogolitsyna A，Becker M，Dupont A L，et al.J Chromatogr A，2011，1218：8561

［8］ Hu Q L，Tan L，Heng Z，et al.Energy Fuels，2012，26：2942

［9］ Wang X，Xu Y，Lian Z N，et al.J Wood Chem Technol，2014，34（1）：67

［10］ Xiong Z Y，Dong Y，Zhou H B，et al.Chinese Journal of Chromatography（熊治渝，董英，周洪斌，等.色譜），2014，32（2）：145

［11］ Huang T Z，Wang S J，Liu X M，et al.Chinese Journal of Chromatography（黃天志，王世杰，劉秀明，等.色譜），2014，32（12）：1356

［12］ Lin X J，Wei W，He Z G，et al.Chinese Journal of Chromatography（林曉婕，魏巍，何志剛，等.色譜），2014，32（3）：304

［13］ Styarini D，Aristiawan Y，Aulia F，et al.Energy Procedia，2013，32：153

［14］ Wang H，Li J J，Cui Z J，et al.Bioresource Technol，2013，136：481

［15］ Guo P，Wang X F，Cui Z J，et al.J Environ Sci-China，2008，20：109