內(nèi)參基因?qū)YR、MITF和ASIP基因在白絨烏骨雞各組織表達(dá)水平的影響

鄭嫩珠，李麗，辛清武，繆中緯，朱志明，劉鳳輝，吳儉飛，盧立志

（1．福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州350013；2．福建省莆田市荔城區(qū)畜牧站，福建莆田351100；3．浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州310021）

內(nèi)參基因?qū)YR、MITF和ASIP基因在白絨烏骨雞各組織表達(dá)水平的影響

鄭嫩珠1，李麗1，辛清武1，繆中緯1，朱志明1，劉鳳輝2，吳儉飛2，盧立志3＊

（1．福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州350013；2．福建省莆田市荔城區(qū)畜牧站，福建莆田351100；3．浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州310021）

以健康白絨烏骨雞肌肉、腎、肝、肌胃和皮膚為試驗(yàn)素材，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)探討β－肌動(dòng)蛋白（beta－actin，ACTB）、3－磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）和18S核糖體RNA（18Sribosomal RNA，18SrRNA）3個(gè)內(nèi)參基因的組織表達(dá)穩(wěn)定性及其對(duì)酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（microphthalmia－associated transcription factor，MITF）和刺鼠信號(hào)蛋白（agouti signaling protein，ASIP）等目的基因在白絨烏骨雞各組織表達(dá)水平的影響，并采用紫外分光光度法分析各組織黑色素沉積規(guī)律，從中篩選出理想的內(nèi)參基因．geNorm和NormFinder軟件分析結(jié)果顯示，內(nèi)參基因GAPDH在白絨烏骨雞各組織表達(dá)穩(wěn)定性最高，ACTB表達(dá)穩(wěn)定性最低．相對(duì)定量和黑色素沉積結(jié)果表明，GAPDH作為內(nèi)參基因時(shí)，各組織MITF、TYR基因的相對(duì)表達(dá)量與黑色素沉積規(guī)律基本一致，表現(xiàn)為皮膚＞腎＞肌胃＞肝＞肌肉；ASIP基因的相對(duì)表達(dá)量與黑色素沉積規(guī)律正好相反，表現(xiàn)為肌肉＞肝＞肌胃＞腎＞皮膚，這與各目的基因?qū)谏爻练e的調(diào)控功能相符，即MITF和TYR基因高表達(dá)有利于黑色素沉積，ASIP基因高表達(dá)則抑制黑色素沉積．而18SrRNA和ACTB作為內(nèi)參基因時(shí)，各目的基因表達(dá)量未表現(xiàn)出上述規(guī)律，與其各自對(duì)黑色素沉積的調(diào)控功能不相吻合，沒有達(dá)到理想的校正效果．表明GAPDH基因穩(wěn)定性最好，且能真正體現(xiàn)目的基因?qū)谏爻练e的表達(dá)調(diào)控，是校正目的基因在白絨烏骨雞不同組織中mRNA表達(dá)量的最優(yōu)內(nèi)參基因．

白絨烏骨雞；內(nèi)參基因；基因表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)；黑色素沉積

Journal of Zhejiang University（Agric．＆Life Sci．），2015，41（6）：732－740

SummarySilky Fowl is a precious local breed containing a large amount of melanin．Therefore，it is considered to have high edible and medicinal value．Study on the related gene expression is helpful to reveal the internalregulation mechanism of melanin deposition．TYR（tyrosinase），MITF（microphthalmia－associated transcription factor）and ASIP（agouti signaling protein）are important candidate genes for the formation of pigment．Real－time fluorescent quantitative polymerase chain reaction（RT－qPCR）has been widely applied to analyze gene expression as a convenient approach，and the selection of appropriate reference genes according to specific samples or conditions is critical to ensure the accuracy and reliability of gene expression．

The objectives of this study are to screen the ideal reference genes and to provide a necessary basis for further study on gene expression regulation of melanin deposition and other important traits in Silky Fowl through investigating the expression stability of reference genes（ACTB，GAPDHand 18S rRNA）and their effects on the expression of melanin genes（TYR，MITFand ASIP）in tissues of Silky Fowl．

RT－qPCR was adopted to investigate mRNA expression levels of the related genes in the muscle，kidney，liver，gizzard and skin of Silky Fowl，and the ultraviolet spectrophotometry was used to measure the melanin content in tissues of Silky Fowl．GeNorm and NormFinder softwares were applied to evaluate the expression stability of reference genes，and 2－△△CTmethod was applied to calculate the relative expression of target gene．

The results from RT－qPCR showed that the melting curve displayed an obvious single peak and standard curves had good linear relationship．Comprehensive evaluation of geNorm and NormFinder indicated that the expression stability of GAPDHwas the highest，while ACTBwas the lowest among the three reference genes in tissues．Relative quantity and melanin content analysis demonstrated that taking GAPDHas a reference gene，the expression level of TYR，ASIPand MITFgenes with the melanin content in tissues had the same trend：skin＞kidney＞gizzard＞liver＞muscle，but the expression level of ASIPgene was opposite to melanin deposition content，which implied that each target gene expression was matched with their respective function on regulating melanin deposition．For instance，high expression of TYRand MITFgenes promoted melanin deposition，while the ASIPgene inhibited melanin deposition．Taking 18S rRNAand ACTBas reference genes，the expression of TYR，MITFand ASIPgenes were not related to the melanin deposition，and an ideal calibration result could not be obtained．

In conclusion，reference gene plays an important role in the expression of target gene．In this paper，GAPDH gene not only had highest expression stability in tissues，but also could truly reflect the regulation effect of the target genes（TYR，MITFand ASIP）on melanin deposition．Thus，GAPDHgene is the most suitable reference gene for normalizing the mRNA expression of genes in tissues of Silky Fowl．

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real－time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT－qPCR）具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)研究中［1－2］．在利用RT－qPCR分析目的基因的表達(dá)水平時(shí)，通常需要引入合適的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，以期消除不同樣本在RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增效率上可能存在的差別［3－5］．目前，β－肌動(dòng)蛋白（betaactin，ACTB）、3－磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）、18S核糖體RNA（18Sribosomal RNA，18SrRNA）基因等常用來(lái)作為內(nèi)參基因．但由于內(nèi)參基因的表達(dá)具有物種和組織特異性［6］，因此需根據(jù)不同樣本類型和試驗(yàn)條件選擇合適的內(nèi)參基因．

白絨烏骨雞作為我國(guó)珍貴的地方品種資源，以黑皮、黑骨、黑肉、黑內(nèi)臟等黑色素性狀顯著區(qū)別于其他普通雞，因體內(nèi)含有大量的黑色素，使其具有極高的滋補(bǔ)與藥用價(jià)值，且顏色愈深，藥效愈好［7－8］．研究白絨烏骨雞黑色素相關(guān)基因表達(dá)對(duì)其黑色素沉積的影響有助于揭示白絨烏骨雞體內(nèi)黑色素沉積的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制，而內(nèi)參基因的選擇對(duì)各基因能否真實(shí)表達(dá)至關(guān)重要．目前關(guān)于白絨烏骨雞內(nèi)參基因的篩選及其黑色素相關(guān)基因在白絨烏骨雞各組織中表達(dá)水平的影響還未見報(bào)道．因此，本研究擬以ACTB、GAPDH和18SrRNA作為候選內(nèi)參基因和白絨烏骨雞肌肉、腎、肝、肌胃、皮膚組織作為試驗(yàn)素材，利用RT－qPCR技術(shù)分析3個(gè)內(nèi)參基因的組織表達(dá)穩(wěn)定性及其對(duì)酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（microphthalmia－associated transcription factor，MITF）和刺鼠信號(hào)蛋白（agouti signaling protein，ASIP）等黑色素相關(guān)基因在白絨烏骨雞各組織中表達(dá)水平的影響，以及使用紫外分光光度法探測(cè)各組織黑色素沉積規(guī)律，旨在篩選出穩(wěn)定性好且能真正體現(xiàn)白絨烏骨雞組織基因特異性表達(dá)的內(nèi)參基因，為深入研究白絨烏骨雞黑色素沉積以及其他重要性狀基因的表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)動(dòng)物和組織采集

從150日齡白絨烏骨雞中挑選出生長(zhǎng)發(fā)育良好的16只雞，公母各半，頸動(dòng)脈放血后，取其肌肉、腎、肝、肌胃、皮膚等組織，置于液氮中速凍，－80℃保存待用．

1．2 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

采用總RNA提取試劑盒（Invitrogen公司，美國(guó)）提取總RNA，然后用脫氧核糖核酸酶Ⅰ（TaKaRa公司，日本）消化處理，Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度和純度，最后將其質(zhì)量濃度調(diào)整至1μg／μL．從各樣品中取出2μg總RNA，利用Oligo（dT）18和SuperScriptTMⅡ反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen公司，美國(guó)）將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，－20℃保存待用．

1．3 引物合成和質(zhì)量檢測(cè)

根據(jù)GenBank上已公布的雞TYR、MITF、ASIP、ACTB、GAPDH和18S rRNA基因序列設(shè)計(jì)定量PCR引物（表1）．以皮膚組織cDNA為模板，利用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增．PCR反應(yīng)體系（20μL）：cDNA 1．5μL、10×緩沖液2．0μL、

2．5μmol／L dNTPs 1．6μL、5U／μL TaKaRa Taq 0．2μL、10μmol／L特異上下游引物各0．5μL，加ddH2O至20μL．PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30s，64℃退火30s，72℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸8min；4℃保存．PCR產(chǎn)物用1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)．

表1 RT－qPCR引物主要信息Table 1 Main information of RT－qPCR primers

1．4 各基因的RT－qPCR檢測(cè)

利用RT－qPCR方法和所設(shè)計(jì)的定量PCR引物（表1）檢測(cè)白絨烏骨雞肌肉、腎、肝、肌胃、皮膚等5個(gè)組織中ACTB、GAPDH、18S rRNA、TYR、MITF和ASIP基因的mRNA表達(dá)情況，反應(yīng)體系（25μL）：模板cDNA 1．0μL，2×Power SYBR?Master Mix 12．5μL，10μmol／L PCR－F 0．5μL，10μmol／L PCRR 0．5μL，ddH2O 10．5μL．每個(gè)樣品重復(fù)3次．反應(yīng)條件：95℃1min；95℃10s，64℃25s（收集熒光），40個(gè)循環(huán)；熔點(diǎn)曲線分析溫度55～95℃．

1．5 各組織黑色素含量測(cè)定

參照Ozeki等［9］和黎觀紅等［10］的紫外分光光度法測(cè)定白絨烏骨雞各組織中黑色素含量．將10 mg組織樣品加入到1mL溶解液 ［V（助溶劑（soluene－350））∶V（水）＝9∶1］中，100℃水浴加熱45min～1h，待組織徹底溶解后立即用Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在500nm處的吸光度值，以D（500nm）表示各樣品的黑色素含量．每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5次．

1．6 數(shù)據(jù)處理與分析

利用geNorm軟件（https：／／genorm．cmgg．be／）和NormFinder軟件（http：／／www．mdl．dk／publicationsnormfinder．hfm）對(duì)各個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析．采用2－△△CT（CT為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）方法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量［11－12］．

2 結(jié)果與分析

2．1 各基因的引物PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果

各基因的引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表明，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性明顯（圖1），且長(zhǎng)度與預(yù)期相符．說明所設(shè)計(jì)的引物可作為RT－qPCR的引物．

圖1 各基因PCR產(chǎn)物擴(kuò)增片段電泳圖Fig．1 Agarose gel electrophoresis of PCR products for thetested genes

圖2 白絨烏骨雞不同組織中3個(gè)內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線和熔點(diǎn)曲線Fig．2 Amplification and melting curves of three reference genes in different tissues of Silky Fowl

2．2 各內(nèi)參基因的RT－qPCR分析

以白絨烏骨雞肌肉、腎、肝、肌胃、皮膚等5個(gè)組織合成的cDNA為模板進(jìn)行RT－qPCR分析．結(jié)果（圖2）顯示，3個(gè)內(nèi)參基因的熔解曲線均只存在一個(gè)明顯的峰值．說明擴(kuò)增特異性良好，無(wú)引物二聚體出現(xiàn)．從3個(gè)內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）可以看出，回歸系數(shù)R2均大于0．99，CT值和起始模板濃度對(duì)數(shù)值均呈良好的線性關(guān)系，擴(kuò)增效率高．因此，可判定該定量結(jié)果可信度高．

圖3 白絨烏骨雞不同組織中3個(gè)內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．3 Standard curve of three reference genes in different tissues of Silky Fowl

2．3 各內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

為篩選理想的內(nèi)參基因，本試驗(yàn)采用geNorm和NormFinder軟件對(duì)3個(gè)內(nèi)參基因在白絨烏骨雞不同組織（肌肉、腎、肝、肌胃、皮膚）的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行雙重評(píng)估．由geNorm軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖4）可以看出，3個(gè)內(nèi)參基因在組織中的表達(dá)穩(wěn)定性各異，GAPDH、18S rRNA和ACTB的表達(dá)穩(wěn)定平均值依次為1．808、1．922和2．343，即表達(dá)穩(wěn)定性由高到低的順序?yàn)镚APDH＞18SrRNA＞ACTB．由NormFinder軟件統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖5）顯示，GAPDH和18S rRNA表達(dá)穩(wěn)定值最小，為2．639，表明二者穩(wěn)定性高．以上2種不同計(jì)算方法所得的結(jié)果基本一致，即GAPDH穩(wěn)定性最高，為最優(yōu)內(nèi)參基因．

圖4 geNorm軟件分析3種內(nèi)參基因在白絨烏骨雞不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定值Fig．4 Expression stability value of reference genes in different tissues of Silky Fowl calculated by geNorm software

圖5 NormFinder軟件分析內(nèi)參基因在白絨烏骨雞不同組織中的表達(dá)穩(wěn)定值Fig．5 Expression stability value of reference genes in different tissues of Silky Fowl calculated by NormFinder software

2．4 各內(nèi)參基因?qū)YR、MITF和ASIP基因在白絨烏骨雞各組織表達(dá)水平的影響

利用2－△△CT方法對(duì)各目的基因在白絨烏骨雞各組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各目的基因在各組織中的表達(dá)水平因內(nèi)參基因不同而有所差別．以18S rRNA為內(nèi)參基因時(shí)，MITF和TYR基因組織表達(dá)量均表現(xiàn)為皮膚＞腎＞肌肉＞肌胃＞肝，ASIP基因表現(xiàn)為肌肉＞肝＞肌胃＞腎＞皮膚（圖6）；以GAPDH為內(nèi)參基因時(shí)，MITF和TYR基因組織表達(dá)量均表現(xiàn)為皮膚＞腎＞肌胃＞肝＞肌肉，ASIP基因表現(xiàn)為肌肉＞肝＞肌胃＞腎＞皮膚（圖7）；以ACTB為內(nèi)參基因時(shí)，MITF和TYR基因組織表達(dá)量均表現(xiàn)為皮膚＞肌肉＞腎＞肝＞肌胃，ASIP基因表現(xiàn)為肌肉＞肝＞腎＞皮膚＞肌胃（圖8）．

圖6 18S rRNA為內(nèi)參基因的白絨烏骨雞不同組織各目的基因相對(duì)表達(dá)量Fig．6 Relative mRNA expression level of target genes in different tissues of Silky Fowl under 18S rRNA as reference gene

圖7 GAPDH為內(nèi)參基因的白絨烏骨雞不同組織各目的基因相對(duì)表達(dá)量Fig．7 Relative mRNA expression level of target genes in different tissues of Silky Fowl under GAPDH as reference gene

圖8 ACTB為內(nèi)參基因的白絨烏骨雞不同組織各目的基因相對(duì)表達(dá)量Fig．8 Relative mRNA expression level of target genes in different tissues of Silky Fowl under ACTBas reference gene

2．5 各組織黑色素沉積與不同內(nèi)參基因各組織目的基因表達(dá)關(guān)系分析

由圖9可知：白絨烏骨雞體內(nèi)黑色素含量因組織不同而異，其中以皮膚黑色素含量最高，與其他組織差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01），腎次之，肌肉含量最低（P＜0．01）．白絨烏骨雞各組織黑色素含量表現(xiàn)為皮膚＞腎＞肌胃＞肝＞肌肉．

圖9 白絨烏骨雞各組織黑色素含量測(cè)定結(jié)果比較Fig．9 Comparison of melanin deposition in different tissues ofSilky Fowl

由以上各組織MITF、TYR和ASIP基因表達(dá)特性與黑色素沉積規(guī)律可以看出：GAPDH作為內(nèi)參基因時(shí)，各組織MITF和TYR基因相對(duì)表達(dá)量與黑色素含量順序相符，ASIP基因相對(duì)表達(dá)量與黑色素含量順序相反，這與各基因?qū)谏爻练e的調(diào)控功能相符，即MITF和TYR基因高表達(dá)有利于黑色素沉積，ASIP基因高表達(dá)則抑制黑色素沉積；而18SrRNA和ACTB作為內(nèi)參基因時(shí)，各目的基因表達(dá)量未表現(xiàn)出上述規(guī)律，沒有真正體現(xiàn)各目的基因?qū)谏爻练e的調(diào)控作用．由此表明，在分析TYR、MITF和ASIP基因在白絨烏骨雞各組織表達(dá)水平時(shí)，可以選擇GAPDH作為校正內(nèi)參基因．

3 討論

RT－qPCR作為一種新型、高效的核酸定量技術(shù)，已成為分子生物學(xué)中基因功能研究的重要工具［2］．但由于RT－qPCR過程影響因素較多，為獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，必須選擇表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為校正標(biāo)準(zhǔn)［13］．眾多研究表明，真正穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因并不存在，只是在特定條件下的相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)［14－16］．因此，根據(jù)具體試驗(yàn)材料和條件選擇適宜的內(nèi)參基因?qū)δ康幕虮磉_(dá)進(jìn)行校正是RT－qPCR分析中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)．本研究從白絨烏骨雞不同組織（肌肉、腎、肝、肌胃、皮膚）3個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)結(jié)果可以看出：經(jīng)geNorm軟件計(jì)算出的3個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性依次為GAPDH＞18SrRNA＞ACTB；經(jīng)NormFinder軟件分析得出GAPDH和18S rRNA穩(wěn)定性高．綜合2個(gè)軟件分析結(jié)果表明，GAPDH表達(dá)最為穩(wěn)定，適于校正白絨烏骨雞各組織目的基因的表達(dá)水平．

黑色素性狀是白絨烏骨雞最顯著的特征，研究黑色素相關(guān)基因表達(dá)對(duì)白絨烏骨雞黑色素沉積的影響在研究和實(shí)踐上均具有重要意義．黑色素的合成是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)，由多個(gè)基因位點(diǎn)編碼產(chǎn)物共同參與調(diào)控［17］．MC1R（黑素皮質(zhì)激素受體l）、TYR、ASIP和MITF是黑色素合成重要的候選基因［18］．在黑色素合成通路中，這4個(gè)基因之間存在重要的聯(lián)系．首先，α－MSH（α－促黑色素激素）與其受體MC1R特異性結(jié)合，激活cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，繼而上調(diào)MITF表達(dá)，MITF作為中介激活TYR、TYRP－1（酪氨酸相關(guān)蛋白1）、TYRP－2（酪氨酸相關(guān)蛋白2）等基因的表達(dá)，并將cAMP產(chǎn)生的信號(hào)傳遞給限速酶基因TYR，啟動(dòng)黑色素的合成［19－20］．ASIP作為MC1R的拮抗劑，則通過與α－MSH競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MC1R，從而引起MITF表達(dá)水平降低，繼而TYR表達(dá)受阻，導(dǎo)致真黑素合成減少［21－22］．因此，在某種程度上MITF和TYR具有協(xié)同效應(yīng)，其高表達(dá)有助于促進(jìn)黑色素合成；ASIP則通過拮抗MC1R抑制MITF和TYR表達(dá)，導(dǎo)致黑色素合成減少．在本研究中，GAPDH作為內(nèi)參基因時(shí)，MITF和TYR基因在不同組織的相對(duì)表達(dá)量與黑色素含量順序相符，均呈現(xiàn)出皮膚＞腎＞肌胃＞肝＞肌肉；ASIP基因表達(dá)量則與黑色素含量順序相反，表現(xiàn)為肌肉＞肝＞肌胃＞腎＞皮膚．由此提示，MITF和TYR高表達(dá)有利于白絨烏骨雞體內(nèi)黑色素沉積，ASIP高表達(dá)則會(huì)抑制白絨烏骨雞體內(nèi)黑色素沉積，這與前人的研究結(jié)果［19－22］相吻合．而18SrRNA和ACTB作為內(nèi)參基因時(shí)，各目的基因表達(dá)量與黑色素沉積并不存在任何關(guān)系，3個(gè)目的基因的表達(dá)未能真正體現(xiàn)各自對(duì)黑色素的調(diào)控功能，沒有達(dá)到理想的校正效果．由此說明，選擇GAPDH作為內(nèi)參基因能夠真正校正各目的基因在白絨烏骨雞各組織的表達(dá)水平．

4 結(jié)論

本研究結(jié)果提示，內(nèi)參基因GAPDH在白絨烏骨雞各組織中的表達(dá)最穩(wěn)定，并且能夠真實(shí)反映TYR、ASIP和MITF等目的基因在白絨烏骨雞各組織的特異性表達(dá)變化；因此，在校正白絨烏骨雞不同組織中目的基因的表達(dá)量時(shí)，內(nèi)參基因GAPDH為最佳選擇．這為后續(xù)研究白絨烏骨雞重要功能基因的定量表達(dá)提供了重要的參考依據(jù)．

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Influence of reference genes on expression of TYR，MITFand ASIPgenes in tissues of Silky Fowl．

Zheng Nenzhu1，Li Li1，Xin Qingwu1，Miao Zhongwei1，Zhu Zhiming1，Liu Fenghui2，Wu Jianfei2，Lu Lizhi3＊
（1．Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou 350013，China；2．Animal Science Station of Licheng District of Putian City in Fujian Province，Putian 351100，F(xiàn)ujian，China；3．Institute of Animal Science and Veterinary Medicine，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China）

Silky Fowl（Gallus gallus domesticus Brisson）；reference gene；gene expression；real－time fluorescent quantitative polymerase chain reaction；melanin deposition

S 831；Q 78

A

10．3785／j．issn．1008－9209．2015．04．131

福建省科技計(jì)劃（2014R1023－2）；福建省種業(yè)創(chuàng)新工程項(xiàng)目（FJZZZY－1504）；浙江省重大科技專項(xiàng)（2014C02001）．

盧立志（http：／／orcid．org／0000－0001－9701－131X），Tel：＋86－571－86406682，E－mail：lulizhibox＠163．com

聯(lián)系方式：鄭嫩珠（http：／／orcid．org／0000－0003－4207－7383），E－mail：zhengnz＠163．com

2015－04－13；接受日期（Accepted）：2015－09－01；< class="emphasis_bold">網(wǎng)絡(luò)出版日期

日期（Published online）：2015－11－18

URL：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／33．1247．s．20151118．1640．002．html