板橋黨參中不同溶劑提取物體外抗氧化活性的研究

張馳++劉信平++張紅玲

摘要：以板橋黨參（Banqiao Codonopsis pilosulc）為原料，分別用去離子水、0.5 mol/L NaCl溶液、75%乙醇、0.1 mol/L KOH溶液為溶劑提取蛋白質(zhì)。采用水提醇沉法，以石油醚脫脂，95 ℃熱水浸提，Sevage試劑脫蛋白，乙醇醇析提取多糖。考馬斯亮藍G-250染色法測定提取的蛋白質(zhì)含量，苯酚-硫酸法測定多糖含量，同時測定不同溶劑提取的蛋白質(zhì)和多糖的還原能力以及對超氧陰離子自由基（O■-·）和羥自由基（·OH）的清除效果。結(jié)果表明，板橋黨參富含蛋白質(zhì)和多糖，并且都具有一定的還原能力和清除超氧陰離子自由基（O■-·）的能力，其中以水溶性蛋白質(zhì)清除自由基的能力最強，多糖清除自由基的能力最弱，但是對羥自由基（·OH）都沒有清除效果。

關(guān)鍵詞：板橋黨參（Banqiao Codonopsis pilosulc）；蛋白質(zhì)；多糖；抗氧化活性

中圖分類號：S567.5+3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2640-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.021

Study on Antioxidant Activity in Vitro of Banqiao Codonopsis pilosulc

by Different Solvent Extraction

ZHANG Chi，LIU Xin-ping，ZHANG Hong-ling

（Biological Scientific and Technical College of Hubei Institute for Nationalities/

Key Laboratory of Biologic Resources Protection and Utilization of Hubei Province， Enshi 445000，Hubei，China）

Abstract： Take Banqiao Codonopsis pilosulc as raw material，the protein was extracted respectively with deionized water，0.5 mol/L NaCl solution，75% ethanol，0.1 mol/L KOH solution as solvents. Using water extraction and alcohol sedimentation method， with petroleum ether degreasing，95 ℃ hot water extraction， Sevage reagent deproteinization， polysaccharide was extracted with ethanol precipitation. The protein content of extract was determined by coomassie brilliant blue G-250 dyeing method. The polysaccharide content of extract was determined by the method of phenol-sulfuric acid. At the same time， the reducibility and the removal effect of superoxide anion free radical （O2-·） and hydroxyl free radical （·OH） of different solvents were investigated. Results showed that Banqiao Codonopsis pilosulc were rich in protein and polysaccharide， which had certain reducibility and the removal effect of superoxide anion free radical （O2-·）， water-soluble proteins with the strongest ability of scavenging free radicals， polysaccharides with the weakest scavenging free radicals， but for hydroxyl free radical （·OH） without effect.

Key words： Banqiao Codonopsis pilosulc； protein； polysaccharide； antioxidant activity

黨參為我國常用的傳統(tǒng)補益藥，古代以西上黨地區(qū)出產(chǎn)的黨參為上品，大量試驗及臨床研究表明黨參或黨參提取物對心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血液及造血功能、消化系統(tǒng)及免疫功能均有有益的作用[1-3]。板橋黨參（Banqiao Codonopsis pilosulc）系桔?？疲–ampanulacea）黨參屬（Codonopsis）植物川黨參（Codonopsis tangshen Oliv.）的干燥根，產(chǎn)于享有“中國硒都”之稱的湖北省恩施市的板橋鎮(zhèn)[1]。該黨參具有藥用、食用、飲用、保健等多種功效，被譽為全國“四大名黨”之首，享譽海內(nèi)外。中醫(yī)常以黨參替代人參入藥，現(xiàn)代醫(yī)學研究表明板橋黨參有治療心血管病、延緩衰老等功效[4，5]。板橋黨參在內(nèi)質(zhì)和外形上較國內(nèi)其他品種均有明顯差別，形成了自己獨特的質(zhì)量特征。

自由基是人體生命活動過程中生物化學反應(yīng)的代謝產(chǎn)物。在正常情況下，人體自由基的產(chǎn)生和清除作用處于動態(tài)平衡之中，但若是體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或消除過慢，則會給機體組織和細胞造成損傷，進而影響碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類、核酸等物質(zhì)代謝，可引起機體的衰老，并誘發(fā)癌癥、心血管疾病等諸多疾病[6-8]，因此需要清除多余自由基。在自然界中，可以作用于自由基的抗氧化劑范圍很廣，種類極多。目前普遍使用的抗氧化劑類藥物分兩種，一種是人工合成的，另一種是從植物中提取出來的（稱天然抗氧化劑），大量研究表明，黨參具有抗氧化之功效，目前對于板橋黨參的研究雖多，但大多集中在化學成分、藥用機理、生理功能等方面的研究，國內(nèi)外尚未見到關(guān)于板橋黨參不同溶劑提取物在抗氧化活性方面的研究。該研究對于了解板橋黨參抗氧化生理功效的機理、從黨參中開發(fā)天然活性物質(zhì)以及增加黨參的利用度等都具有十分重要的意義。endprint

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將板橋黨參采收后洗凈，用去離子水沖洗后置于60 ℃烘箱中48 h烘干，用植物樣品粉碎機粉碎后過60目篩，貯存于干燥器內(nèi)備用。

考馬斯亮藍G-250（上海綠鳥科技發(fā)展有限公司），牛血清蛋白（上海藍季科技發(fā)展有限公司），葡萄糖（Sigma公司），鐵氰化鉀（上海紫一試劑廠），鄰苯三酚（西亞試劑有限公司），石油醚、乙醇、氯仿、正丁醇、Tris試劑、鹽酸、硫酸銨、氯化鋇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚、磷酸、三氯化鐵、三氯乙酸（TCA）、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫等，所用試劑均為分析純，水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

植物樣品粉碎機（上海隆拓儀器設(shè)備有限公司）；電子天平（上海天平廠）；S21-3磁力攪拌器（上海司樂儀器廠）；HWS-l2電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；DGX型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）；SJ-4A pH計（上海雷磁儀器廠）、低速大容量多管離心機（上海安亭科學儀器廠）；722型可見分光光度計（上海光學儀器廠）、超純水器（韓國HUMAN TECHPIA株式會社）；SZ-93A自動雙重蒸餾水器（上海亞榮生化儀器廠）；B-191噴霧干燥儀（瑞士BUCHI公司）。

1.3 方法與步驟

1.3.1 不同溶劑提取樣品中的蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)含量的測定 不同種類的蛋白質(zhì)具有不同的分子量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)，本研究參照姚敏[9]在富硒靈芝中不同種類蛋白質(zhì)的提取方法，對黨參中不同種類蛋白質(zhì)進行了提取、分離與測定。

1）水溶性蛋白質(zhì)的提取[10]。稱取黨參樣品3份，每份1 g，先用丙酮脫脂4 h，在4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)速5 000 r/min，除去上清液。將丙酮揮發(fā)干，加去離子水20 mL，室溫下攪拌提取4 h，在4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)速同上，提取2次。合并上清液，加（NH4）2SO4至飽和，于4 ℃冰箱靜置過夜，4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)速同上，取沉淀透析至BaCl2檢測透析水中SO42-呈陰性為止，通過透析作用對蛋白質(zhì)進行初步純化，以除去其中的小分子物質(zhì)，取蛋白質(zhì)加去離子水定容至50 mL，測定蛋白質(zhì)含量和抗氧化活性。

2）鹽溶性蛋白質(zhì)的提取。分別在水溶性蛋白質(zhì)提取后的殘渣中加0.5 mol/L NaCl 溶液20 mL，在室溫下提取4 h，離心15 min，轉(zhuǎn)速5 000 r/min，提取2次，合并上清液，加（NH4）2SO4至飽和，4 ℃冰箱中靜置過夜，再4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)速同上，取沉淀透析至BaCl2檢測透析水中SO42-呈陰性為止，轉(zhuǎn)出蛋白質(zhì)加0.5 mol/L NaCl溶液定容至50 mL，測定蛋白質(zhì)含量和抗氧化活性。

3）醇溶性蛋白質(zhì)的提取。分別在鹽溶性蛋白質(zhì)提取后的殘渣中加75%乙醇20 mL，室溫下提取4 h，4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)速5 000 r/min。提取2次，合并上清液，加1倍量的去離子水，4 ℃靜置過夜，4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)速同上，取沉淀，凍干，75%乙醇溶解并定容至50 mL，測定蛋白質(zhì)含量和抗氧化活性。

4）堿溶性蛋白質(zhì)的提取。分別在醇溶性蛋白質(zhì)提取后的殘渣中加0.1 mol/L的KOH溶液20 mL，在室溫下提取4 h，4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)速5 000 r/min。提取2次，合并上清液后中和至pH7.0，加（NH4）2SO4至飽和，4 ℃冰箱中靜置過夜，再4 ℃離心15 min，轉(zhuǎn)速同上，取沉淀透析至BaCl2檢測透析水中SO42-呈陰性為止，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)出加0.1 mol/L的KOH溶液定容至50 mL，測定蛋白質(zhì)含量和抗氧化活性。

5）蛋白質(zhì)含量的測定。采用考馬斯亮藍G-250 染色法[11]，先用牛血清蛋白作標準曲線，后測定不同溶劑提取的蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 黨參多糖的提取及其含量的測定[10]。

1）黨參多糖的提取。采用水提醇沉法，稱取黨參樣品3份各1 g，分別加入20 mL石油醚，室溫下攪拌提取4 h脫脂，過濾，至石油醚完全揮發(fā)，分別加去離子水20 mL室溫攪拌提取4 h，提取后4 ℃下5 000 r/min離心15 min，提取2次，合并上清液，95 ℃熱水浸提，減壓濃縮后用Sevage法即氯仿∶正丁醇（4∶1）[12]除去蛋白質(zhì)，加入4倍量95%乙醇，靜置過夜，取多糖沉淀，用85%乙醇洗滌3次，加去離子水定容至50 mL備用。

2）多糖含量的測定。采用苯酚-硫酸法[10]，用葡萄糖標準溶液作標準曲線，測定多糖的含量。

1.3.3 提取物抗氧化活性的測定

1）不同溶劑提取物的總還原能力的測定。采用鐵氰化鉀還原法[13，14]，在10 mL試管中依次加入板橋黨參樣品提取液2.0 mL、2.5 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6） 2.0 mL和1% K3 Fe（CN）6 溶液2.0 mL混合均勻，50 ℃水浴加熱20 min，流水快速冷卻后再加入10%三氯乙酸（TCA）溶液2.0 mL，混合均勻，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.0 mL，依次加入去離子水2.0 mL、0.1% FeCl3溶液0.4 mL，充分混勻，靜置10 min，以去離子水作參比，在700 nm下測定其吸光度（D），D值越大表示還原能力越強[13-15]。

2）超氧陰離子清除率的測定。采用鄰苯三酚自氧化[15，16]原理測定，對照組取50 mmol/L 的Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2） 4.5 ml，加去離子水4.2 mL，混勻，置于37 ℃水浴保溫20 min，立即加入37 ℃預(yù)熱的3 mmol/L鄰苯三酚0.5 mL，迅速搖勻，倒入比色皿中，以10 mmol/L的HCl溶液作對照，每隔30 s測定D325 nm值，連續(xù)測定5 min。樣品組按上述步驟在加入鄰苯三酚之前，加入樣品溶液1 mL，相應(yīng)減少去離子水的量，同樣以10 mmol/L HCl溶液作對照，同樣的方法測D值。endprint

抑制率=（ΔD1/Δt-ΔD2/Δt）/ΔD1/Δt×100%

式中，ΔD1/Δt為鄰苯三酚自氧化時反應(yīng)速率， ΔD2/Δt為加入樣品液后鄰苯三酚自氧化速率。

3）清除羥自由基作用的測定。采用Fenton反應(yīng)，參照文獻[13，17，18]并略作改進，利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH，在10 mL試管中依次加入0.75 mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液1.0 mL、pH 7.4的磷酸鹽（PBS）緩沖液2.0 mL和去離子水1.0 mL，充分混勻，加入0.75 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL，邊加邊搖勻，再加入0.015% H2O2 溶液1.0 mL，置于37 ℃水浴中反應(yīng)60 min，以體積比為1∶2的緩沖液和去離子水作參比液，在536 nm 波長處測其吸光度D損；按上述操作步驟，用1.0 ml去離子水代替1.0 mL 0.015% H2O2，在536 nm波長處測其吸光度D未；用不同黨參提取物代替1.0 mL去離子水，以體積比1∶2∶3的樣品、緩沖液、去離子水作參比，在536 nm處測其吸光度D樣，按下列公式計算清除率。

清除率=（D樣-D損）/（D未-D損）×100%

式中，D樣、D損、D未分別為加入樣品、不加樣品、不加樣品和H2O2 體系的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 黨參中不同種類蛋白質(zhì)的含量

考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白質(zhì)含量，標準曲線y=4.905 7x+0.014，R2=0.997 5。由此可以計算出提取的不同種類蛋白質(zhì)的含量如圖1所示，水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白、堿溶性蛋白含量分別為1.128、0.781、5.776、3.582 mg/g。

2.2 黨參中多糖的含量

苯酚-硫酸法測定多糖含量，標準曲線y=6.705 7x-0.002 3，R2=0.999 3。由此可以計算出板橋黨參樣品的多糖含量為3.700 6 mg/g。

2.3 不同溶劑提取物的抗氧化活性測定結(jié)果

2.3.1 不同溶劑提取物的總還原能力 在還原能力測定反應(yīng)體系中，不同溶劑提取物溶液可以提供電子，使Fe3+還原成Fe2+， 并與自由基形成較穩(wěn)定的物質(zhì)，中斷自氧化連鎖反應(yīng)引起體系吸光度增加，表現(xiàn)出抗氧化作用潛力。所得提取物的還原能力比較如圖2所示。由圖2可知，還原能力大小表現(xiàn)為：水溶性蛋白>堿溶性蛋白>醇溶性蛋白>鹽溶性蛋白>多糖。

2.3.2 對O2-·的清除作用 在弱堿性條件下，鄰苯三酚迅速發(fā)生自氧化，產(chǎn)生超氧陰離子自由基。超氧陰離子自由基清除劑能降低鄰苯三酚的自氧化速率，使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在325 nm處的吸收峰減弱。所得提取物對超氧陰離子自由基的清除率比較如圖3。由圖3可知，水溶性蛋白對超氧陰離子自由基的清除能力最強，醇溶性蛋白的自由基清除能力次之，堿溶性蛋白清除超氧陰離子自由基的能力最弱。

2.3.3 對 ·OH的清除作用 Fenton反應(yīng)是最常見的產(chǎn)生羥自由基的化學反應(yīng)：H2O2+Fe2+→·OH+ OH-+Fe3+，F(xiàn)e2+與鄰二氮菲生成紅色絡(luò)合物，在536 nm波長處有最大吸收峰。當Fe2+-鄰二氮菲被·OH氧化為Fe3+-鄰二氮菲時，536 nm處的吸收峰消失或減弱。本試驗向該反應(yīng)體系中加入一定含量的樣品溶液，如能引起吸光度發(fā)生一定程度的變化，表明樣品可對·OH的生成產(chǎn)生一定抑制作用。試驗測定所得提取物對羥自由基的清除率比較如圖4，結(jié)果顯示，不同溶劑提取的4種蛋白質(zhì)和多糖對羥自由基均沒有清除能力。但pH8.2的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液提取物對·OH自由基的清除率達94.28%，pH6.0的KH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液提取物對·OH自由基的清除率僅為14.89%。

3 小結(jié)與討論

根據(jù)蛋白質(zhì)在不同溶劑中的溶解性不同，將板橋黨參可溶性蛋白質(zhì)分成水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白、堿溶性蛋白；并用水提醇沉法提取多糖。分別測定提取物各組分中的蛋白質(zhì)和多糖含量，并研究其不同組分的還原能力以及對超氧陰離子自由基和羥自由基的清除效果。試驗結(jié)果表明，板橋黨參中多糖含量為3.700 6 mg/g；蛋白質(zhì)的含量以醇溶性蛋白質(zhì)含量最高為5.776 mg/g。蛋白質(zhì)含量多少依次是醇溶性蛋白>堿溶性蛋白>水溶性蛋白>鹽溶性蛋白；不同種類蛋白質(zhì)和多糖都有一定的還原能力和清除超氧陰離子自由基的能力，其中水溶性蛋白質(zhì)還原能力以及清除超氧陰離子自由基的能力最強，多糖的還原能力最弱，堿溶性蛋白質(zhì)清除超氧陰離子自由基的能力最弱；不同種類的蛋白質(zhì)和多糖幾乎沒有清除羥自由基的能力。

研究表明板橋黨參中富含蛋白質(zhì)和多糖，并且均具有較強的還原能力和清除超氧陰離子自由基的能力。板橋黨參中的蛋白質(zhì)和多糖是板橋黨參發(fā)揮抗氧化活性的主要物質(zhì)，與其他類似研究的黨參具有抗氧化、抗應(yīng)激以及調(diào)節(jié)免疫功能等的能力，其主要活性成分之一為黨參多糖（CPP）[19，20]相一致。從已有的研究報道看，關(guān)于黨參多糖的提取分離方法和功能評價較多，但對于黨參中的蛋白功能分析未見報道，本研究表明板橋黨參富含具有抗氧化能力的蛋白質(zhì)和多糖，是很有希望的天然抗氧化劑原料，這類抗氧化劑不僅可以被人體消化吸收，還兼具營養(yǎng)和保健特性，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，還未見到國內(nèi)外對于板橋黨參的抗氧化活性方面的系統(tǒng)研究報道，對板橋黨參的抗氧化活性成分進行充分開發(fā)和利用，具有十分重要的作用。

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