淡紫灰鏈霉菌X33發(fā)酵產(chǎn)物的毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)

段栓成　張宇坤　吳曉玉等

摘要：利用小白鼠進(jìn)行急性和亞急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，研究抑制柑橘綠霉病菌的淡紫灰鏈霉菌菌株X33無菌發(fā)酵液對(duì)小鼠的毒性，并測(cè)定小白鼠血常規(guī)指標(biāo)，觀測(cè)小鼠主要臟器。結(jié)果表明，菌株X33無菌發(fā)酵液的小鼠LD50>10.0 g/kg，受試物屬于無毒級(jí)物質(zhì)；小白鼠經(jīng)28 d喂養(yǎng)，各試驗(yàn)組小白鼠生長(zhǎng)發(fā)育良好，體質(zhì)量、食物利用率及血常規(guī)與對(duì)照組之間無顯著差異；對(duì)小白鼠肝、腎、脾、胃、腸、十二指腸、睪丸（或卵巢）等主要臟器進(jìn)行組織解剖，均未見病變。淡紫灰鏈霉菌菌株 X33無菌發(fā)酵液對(duì)小鼠安全、無毒。

關(guān)鍵詞：淡紫灰鏈霉菌X33；無菌發(fā)酵液；毒性試驗(yàn)；小白鼠；血常規(guī)

中圖分類號(hào)： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0275-02

柑橘采后損失主要由霉菌、酵母菌、細(xì)菌等病原菌侵染造成，其中，柑橘青霉病和綠霉病是柑橘采后主要的兩大貯藏病害。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由于青霉病和綠霉病感染導(dǎo)致的柑橘采后損失率為30%～50%[1]。目前，柑橘采后病害主要使用化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，這容易污染環(huán)境，使病原菌產(chǎn)生抗藥性，防病效果降低[2]。此外，頻繁和高濃度使用化學(xué)藥劑，不僅會(huì)影響果實(shí)的自然風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)，果實(shí)表面還會(huì)存在殘留，威脅消費(fèi)者的健康和安全。

生物防治是采用微生物菌株或抗生素類物質(zhì)，通過噴灑或浸漬果實(shí)處理，以降低或防治果實(shí)采后病害的保鮮方法，高效、無毒、生產(chǎn)成本低廉，是未來的發(fā)展方向[3]。江西南昌市發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以柑橘綠霉病菌為靶標(biāo)，開展菌株的分離和篩選研究，從土壤中分離篩選到1株淡紫灰鏈霉菌（Streptomyces lavendulae），命名為淡紫灰鏈霉菌X33，其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)對(duì)柑橘綠霉病菌、柑橘青霉病菌、柑橘酸腐病菌等多種病原菌均有較強(qiáng)的抑制活性，有望開發(fā)為新型的柑橘采后防腐劑。本研究通過對(duì)淡紫灰鏈霉菌X33發(fā)酵液進(jìn)行毒理學(xué)試驗(yàn)，旨在探討淡紫灰鏈霉菌X33發(fā)酵液的使用安全性，為其進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 淡紫灰鏈霉菌X33，由江西省南昌市發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離得到。

1.1.2 受試物 淡紫灰鏈霉菌X33在28 ℃、200 r/min下?lián)u瓶發(fā)酵培養(yǎng)3 d，發(fā)酵液經(jīng)6 000 r/min離心10 min，上清液用0.45 μm濾膜過濾，即得無菌發(fā)酵液。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及試劑 遠(yuǎn)交昆明小鼠，自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院購買；所用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 選用體質(zhì)量為18～22 g的小白鼠20只，分2個(gè)試驗(yàn)組，每組雌雄各5只，采用一次性經(jīng)口灌胃方式，灌胃菌株X33無菌發(fā)酵液20 mL/kg，劑量相當(dāng)于 10 g/kg；另取10只小白鼠（雌雄各半），給清水作為對(duì)照。小鼠首次飼喂時(shí)，隔夜空腹，禁食16 h，僅喂水；試驗(yàn)前先正常飼喂3 d，使其適應(yīng)試驗(yàn)環(huán)境。灌胃后，連續(xù)14 d觀察小白鼠的行為狀況、中毒癥狀，記錄各組實(shí)驗(yàn)小鼠死亡數(shù)，并及時(shí)剖檢并記錄結(jié)果。

1.2.2 亞急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 選小白鼠80只，隨機(jī)分為4組，每組20只，雌雄各半。試驗(yàn)設(shè)灌胃菌株X33發(fā)酵液1、05、0.01 g/kg共3個(gè)劑量組，以灌胃蒸餾水為對(duì)照組。每天觀察并記錄各組小白鼠的體征表現(xiàn)、行為、中毒癥狀和死亡情況[4]。自由進(jìn)食飲水，每周稱量1次體質(zhì)量，記錄飲水量、食物攝入量，計(jì)算食物利用率[5]。

1.2.3 發(fā)酵液對(duì)小白鼠血常規(guī)指標(biāo)和主要臟器的影響 亞急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)束，從每籠中隨機(jī)抓取3只小白鼠，頸椎脫臼法處死，立即用注射器插入心臟采集血液，分析血液生化指標(biāo)，并同時(shí)進(jìn)行組織解剖檢查。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)期間，各試驗(yàn)組小白鼠飲食和活動(dòng)正常，生長(zhǎng)發(fā)育良好，體質(zhì)量有所增加，未見任何明顯中毒表現(xiàn)，也無死亡；小白鼠喂養(yǎng)14 d進(jìn)行解剖，肉眼觀察其心、肝、脾、肺、腎、腸等臟器，與對(duì)照組相比，皆未發(fā)現(xiàn)明顯病變和差異。紫灰鏈霉菌X33無菌發(fā)酵液的飼喂劑量達(dá)10 g/kg時(shí)不會(huì)引起小白鼠死亡，按現(xiàn)行2005年《化學(xué)品毒性鑒定技術(shù)規(guī)范》急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)的毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]劃分，受檢物屬于無毒級(jí)物質(zhì)。

2.2 亞急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

2.2.1 一般觀察結(jié)果 喂養(yǎng)28 d，對(duì)照組與喂養(yǎng)組小白鼠均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，各處理組小白鼠的生長(zhǎng)狀況、行為狀態(tài)、外觀體征、飲食和排便等均與對(duì)照組差異不明顯，淡紫灰鏈霉菌X33無菌發(fā)酵液對(duì)小白鼠生理功能損害不明顯。

2.2.2 喂養(yǎng)28 d的小白鼠進(jìn)食量和食物利用率 由表1可知，各處理組與對(duì)照組之間差異不顯著（P>0.05），淡紫灰鏈霉菌X33無菌發(fā)酵液喂養(yǎng)小白鼠，對(duì)小白鼠體質(zhì)量增加、進(jìn)食量和食物利用率影響不明顯。

2.3 發(fā)酵液對(duì)小白鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響

由表2可知，各飼喂劑量組的小白鼠紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板及血紅蛋白數(shù)均在正常范圍之內(nèi)，淡紫灰鏈霉菌X33發(fā)酵液對(duì)小白鼠的血常規(guī)指標(biāo)影響不明顯。

2.4 發(fā)酵液對(duì)小白鼠主要臟器的影響

對(duì)各組小白鼠進(jìn)行組織解剖，發(fā)現(xiàn)各處理小白鼠肝、腎、脾、胃、腸、十二指腸、睪丸和卵巢等主要臟器的顏色、形狀、大小均未見病理改變，未見膀胱、肝膽管結(jié)石，肝體比、腎體比、脾體比、睪丸體比和卵巢體比等臟器參數(shù)與對(duì)照組差異不顯著（P>0.05），較長(zhǎng)期服用淡紫灰鏈霉菌X33無菌發(fā)酵液對(duì)小白鼠的組織解剖學(xué)結(jié)構(gòu)影響不明顯。

3 結(jié)論與討論

拮抗微生物可利用其代謝產(chǎn)物抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖，其產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)種類繁多，主要有細(xì)菌素、揮發(fā)性物質(zhì)、蛋白酶類、脂肽及多肽類等等，這些物質(zhì)通過干擾敏感病原菌的代謝過程而抑制其生長(zhǎng)[7]。以枯草芽胞桿菌為例，人們已從枯草芽胞桿菌不同菌株中分離出幾十種抗菌物質(zhì)，在柑橘病害防治中顯示出巨大潛力。Leelasuphakul等從土壤中分離到205株枯草芽胞桿菌，其中23株對(duì)柑橘綠霉病菌均具有較好的拮抗性，有望開發(fā)為柑橘采后保鮮的生防菌[8]。淡紫灰鏈霉菌不同種類菌株可發(fā)酵產(chǎn)生鏈絲菌素、薰衣草菌素、中生菌素和農(nóng)抗402[9-10]，可用于防治番茄灰霉病、番茄葉霉病、葡萄白腐病、西瓜枯萎病和蘋果輪紋病等[9，11-15]。endprint

江西省南昌市發(fā)酵應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離篩選得到淡紫灰鏈霉菌X33，其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)柑橘綠霉病菌、柑橘青霉病菌、柑橘酸腐病菌等多種植物病原菌均有較強(qiáng)的抑制活性，而有關(guān)淡紫灰鏈霉菌用于防治柑橘采后綠霉病的相關(guān)毒理學(xué)試驗(yàn)未見研究報(bào)道。本試驗(yàn)結(jié)果表明，淡紫灰鏈霉菌X33發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)小白鼠LD50>10g/kg，屬安全無毒物質(zhì)；小白鼠喂養(yǎng)發(fā)酵液28 d，其行為體征、生長(zhǎng)發(fā)育、體質(zhì)量增加量、食物利用率、血液生化指標(biāo)、臟體及組織病理學(xué)的不良影響均不明顯，可見淡紫灰鏈霉菌X33發(fā)酵液對(duì)小白鼠具有較好的安全性。

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