臨床生化綜合性實(shí)驗(yàn)
——肥胖大鼠血糖血脂的檢測(cè)

李 姣,方小楠,胡安南,呂立夏,徐 磊,徐國(guó)彤

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,上海 200092)

臨床生化綜合性實(shí)驗(yàn)
——肥胖大鼠血糖血脂的檢測(cè)

李 姣,方小楠,胡安南,呂立夏,徐 磊,徐國(guó)彤

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,上海 200092)

針對(duì)二年級(jí)的醫(yī)學(xué)生,結(jié)合與物質(zhì)代謝相關(guān)的臨床疾病——肥胖及糖尿病,將原有臨床生化實(shí)驗(yàn)重新調(diào)整,設(shè)計(jì)成一組綜合性實(shí)驗(yàn),通過構(gòu)建營(yíng)養(yǎng)型肥胖大鼠模型,使學(xué)生通過實(shí)驗(yàn)觀察正常和肥胖大鼠血糖水平、血漿脂蛋白成分的變化，以及2組大鼠對(duì)胰島素的敏感性。結(jié)合理論課糖類和脂類代謝的內(nèi)容,激發(fā)學(xué)生對(duì)于疾病的思考,更好地理解代謝異常所導(dǎo)致疾病的發(fā)病機(jī)制,為將來的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

臨床生化實(shí)驗(yàn);營(yíng)養(yǎng)型肥胖;血糖;血脂;胰島素

血糖和血脂的檢測(cè)是臨床生化實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容。這部分實(shí)驗(yàn)主要涉及生物化學(xué)理論課糖類和脂類代謝的知識(shí),臨床上常見的糖尿病、高脂血癥及相關(guān)的高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化都與這部分內(nèi)容緊密相關(guān)。以往的實(shí)踐中,血糖和血脂的檢測(cè)是分別放在2個(gè)不同的實(shí)驗(yàn),血糖檢測(cè)中只觀察了胰島素的降血糖效應(yīng),血脂檢測(cè)中只進(jìn)行了脂蛋白電泳,學(xué)生對(duì)于肥胖疾病模型的構(gòu)建和相應(yīng)代謝指標(biāo)的變化并沒有整體和系統(tǒng)的了解。針對(duì)上述不足,將實(shí)驗(yàn)重新調(diào)整,將其設(shè)計(jì)成相對(duì)完整的綜合性的臨床生化實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)改革已在醫(yī)學(xué)本科生教學(xué)中連續(xù)應(yīng)用2年。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

在實(shí)驗(yàn)中,學(xué)生首先觀察到部分進(jìn)食高脂飲食的大鼠體重明顯大于正常飲食大鼠,并將大鼠分成對(duì)照組和肥胖組;接下來剪尾取血檢測(cè)2組大鼠的血糖和進(jìn)行胰島素的敏感度實(shí)驗(yàn);同時(shí)將2組大鼠的血漿進(jìn)行脂蛋白電泳觀察脂蛋白成分的變化;最后匯總數(shù)據(jù)進(jìn)行分析討論。通過參與整個(gè)實(shí)驗(yàn),學(xué)生對(duì)肥胖及其相關(guān)的血糖和血脂代謝異常印象深刻,加深了對(duì)理論課內(nèi)容的理解和記憶,同時(shí)激發(fā)了對(duì)于疾病發(fā)病機(jī)制的思考,為醫(yī)學(xué)生將來的臨床實(shí)踐和應(yīng)用打下良好基礎(chǔ)。

目前的研究表明,肥胖與糖尿病、高脂血癥及相關(guān)的高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)病密切相關(guān)[1-2](見圖1),其發(fā)病機(jī)制主要是由于脂肪組織所產(chǎn)生的細(xì)胞因子所致。脂肪組織不僅是能量?jī)?chǔ)存器官,還是機(jī)體重要的內(nèi)分泌器官,可產(chǎn)生多種激素和因子,如瘦素(leptin)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、脂聯(lián)素、內(nèi)脂素、抵抗素、白細(xì)胞介素-6等,統(tǒng)稱為脂肪細(xì)胞因子[3-5]。這些因子對(duì)機(jī)體的物質(zhì)能量代謝及其調(diào)節(jié)有重要影響[6-7],肥胖時(shí)脂肪細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生變化,其中脂聯(lián)素是目前最明確和最重要的一個(gè)具有抗胰島素抵抗作用的脂肪細(xì)胞因子,參與糖、脂的代謝,體重增加時(shí)血清脂聯(lián)素水平明顯降低,而瘦素、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-6等水平增高,結(jié)合其他相關(guān)因子的相互作用進(jìn)而導(dǎo)致葡萄糖耐量異常、高脂血癥、糖尿病和視網(wǎng)膜病等一系列疾病的發(fā)生。

圖1 肥胖與很多疾病相關(guān)

糖類代謝和脂類代謝是醫(yī)學(xué)生生物化學(xué)物質(zhì)代謝章節(jié)的主要內(nèi)容,其代謝異常是導(dǎo)致臨床很多疾病的發(fā)病原因。為使學(xué)生更好地理解理論知識(shí)并聯(lián)系臨床應(yīng)用,同時(shí)提高學(xué)生學(xué)習(xí)的興趣,將臨床生化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)成相對(duì)連續(xù)完整的從肥胖模型建立到血糖血脂檢測(cè)的綜合設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn),使學(xué)生能夠觀察疾病的發(fā)生發(fā)展,在實(shí)踐中激發(fā)對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制的思考。

2 實(shí)驗(yàn)課程基本流程

本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容是二年級(jí)醫(yī)學(xué)生“生命科學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)Ⅰ”課程中9個(gè)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中的一個(gè)。本實(shí)驗(yàn)一共6個(gè)學(xué)時(shí),每班有16個(gè)學(xué)生,2個(gè)學(xué)生一組。成績(jī)由3部分組成:筆試 (30%)、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(50%)、操作表現(xiàn)和出勤(20%)。表1為實(shí)驗(yàn)安排。

表1 臨床生化實(shí)驗(yàn)安排

2.1 實(shí)踐 1: 大鼠稱重和喂養(yǎng)

成年雄性SD大鼠購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。每組2個(gè)學(xué)生操作1只大鼠,每班有12只大鼠,多出的大鼠留作備用(以備死亡或肥胖抵抗)。本實(shí)驗(yàn)的目的是建立肥胖大鼠模型,進(jìn)而檢測(cè)肥胖大鼠和對(duì)照大鼠的血糖、血脂和胰島素調(diào)節(jié)情況。

隨機(jī)將大鼠分成對(duì)照組和高脂飲食組,喂養(yǎng)4周。大鼠飼養(yǎng)在醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心,由專門的技術(shù)人員每天照看。高脂飲食譜:正常飲食 60.7 %,豬油 12 %,蔗糖 8 %,全脂奶粉5 %,膽固醇2 %,蛋黃粉 10 %,膽鹽0.3 %,鹽2 %[8]。

4周喂養(yǎng)結(jié)束,每班學(xué)生對(duì)大鼠稱重。對(duì)照組和高脂組各選4只進(jìn)行后繼實(shí)驗(yàn)。高脂組中選取體重超過對(duì)照20%的大鼠。大鼠體重比較見表2。8只大鼠分別進(jìn)行標(biāo)記,并在實(shí)驗(yàn)前一天禁食12 h。整個(gè)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心的學(xué)生實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

表2 對(duì)照和高脂組大鼠體重比較

注: 1.體重:喂養(yǎng)4周后體重;2.*P<0.01 與對(duì)照組比較

2.2 實(shí)踐 2: 血糖檢測(cè),胰島素耐量實(shí)驗(yàn),脂蛋白電泳

整個(gè)檢測(cè)可分成3部分。

第一部分:

教師首先對(duì)本次檢測(cè)的原理和操作做一詳細(xì)的闡述。本次授課最大的特色在于給學(xué)生演示胰島素注射和剪尾取血的視頻,本視頻由經(jīng)驗(yàn)豐富的教師擔(dān)任主角,以簡(jiǎn)潔、輕松并帶幽默的方式示教,使艱苦的工作有個(gè)輕松的開始。

第二部分:

首先剪尾取血:將鼠尾在45 ℃溫水中浸泡數(shù)min,擦干鼠尾,將尾尖剪去5 mm(大鼠)。從尾根部向尾尖部按摩,血即從斷端流出,讓血液滴入試管。取血后,用棉球壓迫止血,保護(hù)傷口。接下來注射激素與后繼采血:皮下或腹腔內(nèi)注射胰島素,0.75 IU/kg(60 U/kg),分別在30,60,90和120 min后取血0.2～0.3 mL,標(biāo)明胰1-4。3 000 r/min離心5 min,分離血清。加入抗凝劑時(shí),3 000 r/min離心5 min,分離血漿。

第三部分:

(1) 血糖測(cè)定。葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法),見表3。將樣品置37 ℃水浴 10 min,用波長(zhǎng) 505 nm,空白管調(diào)“零”點(diǎn)測(cè)定各管的吸光度(A)值。

(2) 預(yù)染血清(血漿)。各處理組血清0.2 mL中加入蘇丹黑B染色液0.02 ml,混勻后置42oC水浴30 min,離心(2 000 r/min)5 min。

(3) 電泳。預(yù)染血清樣品近負(fù)極端,接通電源,電壓100～120 V，電泳約45 min。學(xué)生記錄數(shù)據(jù)并拍照。

表3 血糖測(cè)定葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法) μL

2.3 實(shí)踐 3: 數(shù)據(jù)分析和討論

學(xué)生制作PPT,顯示數(shù)據(jù),進(jìn)行分析討論。數(shù)據(jù)見表4和圖2。從上述2個(gè)主要的結(jié)果可以看到,肥胖組大鼠的空腹血糖與對(duì)照組相比有升高,而且對(duì)胰島素降血糖的敏感度也低于對(duì)照組;血漿脂蛋白電泳結(jié)果中,高脂組的低密度脂蛋白(LDL)含量與對(duì)照組相比增加。

表4 空腹血糖的比較

注:*P<0.01 與對(duì)照組比較。

圖2 胰島素耐量實(shí)驗(yàn)

3 討論

建立疾病動(dòng)物模型是研究疾病的常用方法。建立肥胖大鼠模型的技術(shù)比較成熟易操作,并且重復(fù)性也較好[9-12]。本實(shí)驗(yàn)課程從造模到檢測(cè)再到數(shù)據(jù)分析討論,學(xué)生通過整個(gè)流程對(duì)疾病的研究方法和代謝變化有了一個(gè)基本的認(rèn)識(shí)和體會(huì)。

在第一步中,學(xué)生首先對(duì)成年大鼠進(jìn)行稱重,在教師的指導(dǎo)下,學(xué)生對(duì)大鼠的一些基本習(xí)性和抓取方法有一個(gè)簡(jiǎn)單了解,并對(duì)大鼠的大小有一個(gè)直觀的認(rèn)識(shí),加深對(duì)大鼠生長(zhǎng),尤其是高脂飲食組體重增長(zhǎng)明顯的直觀印象。通過觀察,學(xué)生在最后的討論中意識(shí)到飲食結(jié)構(gòu)能夠明顯地影響體重。

在第二步中,教師制作的視頻簡(jiǎn)短而輕松,學(xué)生都能夠認(rèn)真觀看并印象頗深,接下來在教師的指導(dǎo)下通過激素注射和反復(fù)的剪尾取血,可以看到每小組2個(gè)學(xué)生的操作越來越熟練，并且合作也越來越默契,大大提高了學(xué)生的動(dòng)手能力。通過離心觀察到與正常飲食大鼠血漿相比,有2只高脂飲食大鼠的血漿明顯變得渾濁,從而加深對(duì)高脂飲食影響體內(nèi)代謝的直觀認(rèn)識(shí)。

接下來通過對(duì)血糖血脂的檢測(cè)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到高脂飲食會(huì)導(dǎo)致血糖的升高和對(duì)胰島素降血糖調(diào)節(jié)的抵抗。

在第三步的討論中,學(xué)生已經(jīng)對(duì)高脂飲食對(duì)機(jī)體造成的影響有了比較清晰的認(rèn)識(shí),并且聯(lián)系自身的生活習(xí)慣，提高了預(yù)防疾病的意識(shí),同時(shí)教師聯(lián)系學(xué)生所學(xué)生化理論知識(shí)和臨床疾病,如Ⅱ型糖尿病和高脂血癥進(jìn)行總結(jié)性講解,進(jìn)一步加強(qiáng)了學(xué)生對(duì)所學(xué)生化基礎(chǔ)知識(shí)的臨床應(yīng)用。

4 結(jié)束語

通過本實(shí)驗(yàn),學(xué)生提高了動(dòng)手能力、增強(qiáng)了團(tuán)隊(duì)意識(shí),并且將所學(xué)的生化知識(shí)應(yīng)用于生活和臨床。本實(shí)驗(yàn)適合作為設(shè)計(jì)性臨床生化實(shí)驗(yàn)推廣應(yīng)用。

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Integrated experiment-clinical biochemistry determination of obese rat’s blood glucose and lipoprotein

Li Jiao,Fang Xiaonan,Hu Annan,Lü Lixia,Xu Lei,Xu Guotong

(Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Medicine,Tongji University,Shanghai 200092,China)

For Grad 2 medical students,this paper puts forward to redesign the original experiment and develop a relatively integral clinical biochemistry experiment. During experimental period, the students observe obesity resulted from high fat diet,abnormal insulin tolerance and lipoprotein content change in obese rat. The students are not only exposed to techniques and equipment but also inspired to think more about disease. Associated with lecture topics about metabolism of carbohydrates and lipids,the students get a better understanding about relevance of carbohydrates and lipid metabolism to related disease. It can lay a profound foundation for medical student’s clinical application.

clinical biochemistry experiment;nutritional obesity;blood glucose;blood lipoprotein;insulin

2014- 05- 12 修改日期：2014- 07- 18

同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革第6期項(xiàng)目“激素和飲食對(duì)大鼠糖類和脂類代謝的影響”

李姣(1977—),女,遼寧沈陽,博士,講師,生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)

呂立夏(1969—),女,河南，博士,副教授,研究方向?yàn)楦杉?xì)胞分子生物學(xué).

E-mail：li2sister@163.com

G642.423

A

1002-4956(2015)1- 0185- 03