Cr（Ⅵ）鹽脅迫下小麥種子中淀粉酶活性的響應(yīng)

張艷杰　李桂玲　王金水等

摘要：研究重金屬離子Cr（Ⅵ）在不同濃度下對小麥種子萌發(fā)及其幼苗生長的影響。結(jié)果表明：Cr（Ⅵ）對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長影響的臨界值為18 mg/L，即濃度低于18 mg/L的Cr（Ⅵ）促進小麥種子的萌發(fā)和幼苗的生長，高于 18 mg/L則抑制小麥種子的萌發(fā)和幼苗的生長；Cr（Ⅵ）對根生長的抑制作用大于對芽生長的抑制作用；高濃度的 Cr（Ⅵ） 對小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制是通過抑制淀粉酶的活性來實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：Cr（Ⅵ）；小麥種子；萌發(fā)；淀粉酶；同工酶

中圖分類號： Q946.5；Q945.78 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0073-03

鉻（chromium，Cr）是自然環(huán)境中存在的1種重金屬元素，同時也是1種重要的環(huán)境污染物，被列為工業(yè)“五毒”之一。鉻在自然界中主要以三價鉻（Cr3+）、六價鉻[Cr（Ⅵ）]的化合物形式存在，且后者的毒性比前者更強[1-2]。已有研究證明，Cr（Ⅵ）不是植物生長發(fā)育的必需元素，在植物體內(nèi)過量積累對植物的生長發(fā)育有明顯的抑制作用[3]。近年來，隨著印染、電鍍、化工、電子等行業(yè)的發(fā)展，越來越多的含鉻廢水、廢渣被排放到水體中，導(dǎo)致農(nóng)田灌溉用水污染嚴(yán)重，進而對農(nóng)作物的生長發(fā)育造成了巨大傷害，這不僅降低了農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且能夠通過食物鏈進入人體，危害人類健康[4]。

小麥（Triticum aestivum Linn.）是我國重要的糧食作物，對于小麥的研究具有重要的經(jīng)濟價值和現(xiàn)實意義，其產(chǎn)量和品質(zhì)也越來越受到關(guān)注[5]。有關(guān)調(diào)查顯示，受重金屬污染的農(nóng)田耕地面積占總耕地面積的1/5，其中受鉻污染的尤為嚴(yán)重[6]，因此研究鉻污染對小麥種子生長發(fā)育的影響極其重要。

目前，關(guān)于Cr（Ⅵ）鹽對小麥生長發(fā)育影響的研究多數(shù)是集中在對萌發(fā)及幼苗生長階段形態(tài)學(xué)指標(biāo)的檢測分析方面，而關(guān)于Cr（Ⅵ）鹽對小麥不同發(fā)育階段形態(tài)指標(biāo)的影響是如何實現(xiàn)的研究則鮮有報道。本研究圍繞這一問題，以小麥為試驗材料，采用室內(nèi)水培法對小麥?zhǔn)┮圆煌瑵舛忍荻鹊腃r（Ⅵ）溶液，研究Cr（Ⅵ）鹽對小麥種子萌發(fā)及幼苗生長期間關(guān)鍵酶——淀粉酶活性的影響，以期為重金屬Cr（Ⅵ）對小麥生長毒害機理的研究，以及耐、抗重金屬Cr（Ⅵ）鹽品種的選育提供理論支持和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥選用溫麥6號，產(chǎn)自河南省黃泛區(qū)農(nóng)場。試劑為華美生物工程公司生產(chǎn)的重鉻酸鉀（K2Cr2O7，分析純）。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理與試驗設(shè)計 挑選大小均一、籽粒飽滿的溫麥6號種子，先用5%H2O2處理5 min進行表面消毒，然后用蒸餾水沖洗3～5遍，再加蒸餾水沒過種子最上層2 cm左右，浸種12 h。將小麥種子腹溝向下排列在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿40粒，使每粒種子間留有均勻的間距，以防發(fā)霉種子對健康種子的感染。在培養(yǎng)皿中分別加入5 mL不同梯度濃度（3、5、10、15、18、20、25、30 mg/L，以Cr（Ⅵ）計）的K2Cr2O7溶液；對照（CK）用蒸餾水培養(yǎng)，每個濃度梯度均設(shè)置6個重復(fù)，置于室溫、自然光照下培養(yǎng)萌發(fā)，處理時間分別為3、7 d。所設(shè)的6個重復(fù)中3個重復(fù)用于培養(yǎng)3 d的形態(tài)學(xué)和生理指標(biāo)測定；另外3個重復(fù)用于培養(yǎng)7 d的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)指標(biāo)測定。

1.2.2 形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測定 測定培養(yǎng)3、7 d小麥的芽長、根長。記錄的數(shù)據(jù)用Excel 2003進行成組數(shù)據(jù)t檢驗的統(tǒng)計分析。

1.2.3 生理學(xué)指標(biāo)測定 待種子培養(yǎng)3、7 d后，分別去掉種皮，稱取0.5 g置于預(yù)冷的研缽中，加入少量石英砂和2 mL蒸餾水，研磨勻漿后轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，用蒸餾水定容至10 mL，4 ℃、10 000 r/min條件離心15 min，上清液即為粗酶液。取上清液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法（PAGE）測定萌發(fā)種子淀粉酶同功酶活性，分離膠濃度為7.2%，濃縮膠濃度為3.2%[7]。于日光燈下觀察記錄酶譜，用數(shù)碼相機進行拍照。須要測量的數(shù)據(jù)有脫色前后膠長、指示劑游動距離、酶帶長。計算遷移率相關(guān)公式為V=mE。式中：V為溶液中帶電粒子的移動速度，cm/s；m為粒子的有效遷移率，cm3/（V·s）；E為電場，V/m。同時，采用分光光度法（3，5-二硝基水楊酸法）測定萌發(fā)種子的α-淀粉酶同工酶活性[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cr（Ⅵ）溶液對小麥主要形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

2.1.1 Cr（Ⅵ）溶液對小麥胚芽的影響 如圖1所示，用不同濃度梯度Cr（Ⅵ）鹽處理后，萌發(fā)3 d的小麥胚芽芽長在低濃度處理時略高于對照；相反，在高濃度處理時比對照低。與對照相比，Cr（Ⅵ） 處理濃度為3～15 mg/L時，可以刺激小麥胚芽的生長，對小麥胚芽生長起到了促進作用，其中處理濃度在 10 mg/L 時對小麥胚芽的生長有極顯著的促進作用；當(dāng) Cr（Ⅵ） 處理濃度提高至18 mg/L時，小麥胚芽的長度開始呈現(xiàn)下降趨勢，芽長與對照基本相同；處理濃度為20 mg/L時，小麥種子胚芽的生長受到了極顯著的抑制；隨著Cr（Ⅵ）鹽濃度的繼續(xù)升高，受抑制程度更為嚴(yán)重，結(jié)果見表1。處理7 d的小麥胚芽生長規(guī)律與處理3 d的小麥胚芽生長規(guī)律總體趨勢表現(xiàn)一致，結(jié)果如圖2所示。因此推測，18 mg/L的Cr（Ⅵ）處理濃度為影響小麥種子萌發(fā)和幼苗生長的臨界值。

2.1.2 Cr（Ⅵ）溶液對小麥胚根的影響 用不同濃度梯度的Cr（Ⅵ）處理后，與對照相比，對萌發(fā)3、7 d的小麥胚根的生長均有抑制作用，且均達(dá)到了極顯著水平，結(jié)果見圖1、圖2、表1。這說明用不同濃度Cr（Ⅵ）處理后，小麥胚根的生長狀況與胚芽不同；高濃度（>18 mg/L）的Cr（Ⅵ）處理時，Cr（Ⅵ）濃度越高，抑制效應(yīng)越強，且對小麥種子胚根生長的抑制作用大于胚芽。

2.2 Cr（Ⅵ）溶液對小麥生長發(fā)育過程中關(guān)鍵酶淀粉酶活性的影響

2.2.1 Cr（Ⅵ）溶液對小麥幼苗生長過程中淀粉酶同工酶活性的影響 如圖3所示，不同濃度Cr（Ⅵ）處理7 d 的小麥總淀粉酶同功酶譜帶共有6條，依次標(biāo)為a、b、c、d、e、f。與對照相比，Cr（Ⅵ）處理濃度為3～15 mg/L時，6條同工酶的譜帶寬度和亮度均高于對照，且在10 mg/L時的譜帶最寬、亮度最強；Cr（Ⅵ）處理濃度為18 mg/L時，6條同工酶譜帶寬度、亮度基本和對照相同；Cr（Ⅵ）處理濃度為20～30 mg/L時，a、d、e、f 4條同工酶的表達(dá)均受到不同程度的抑制，尤其是處理濃度達(dá)到 30 mg/L 時，a、b 2條譜帶消失，d、e、f 3條同工酶譜帶明顯變淺、變窄。結(jié)果表明，隨著Cr（Ⅵ）濃度的升高，小麥幼苗生長過程中淀粉酶同工酶的活性與表達(dá)呈現(xiàn)先增后降特征；總體變化趨勢與Cr（Ⅵ）處理后小麥種子胚芽的生長規(guī)律基本一致，其中高濃度Cr（Ⅵ）（>18mg/L）處理時對淀粉酶同工酶的抑制作用同于對胚根的抑制作用?？傮w結(jié)果說明，Cr（Ⅵ）處理對小麥生長發(fā)育的影響可能是通過影響淀粉酶活性來實現(xiàn)的。

2.2.2 Cr（Ⅵ）溶液對小麥α-淀粉酶活性的影響 α-淀粉酶是植物種子萌發(fā)過程中產(chǎn)生的重要酶，因此其活性的高低與種子活力大小、種子是否能夠萌發(fā)密切相關(guān)。如圖4所示，Cr（Ⅵ）處理3、7 d的小麥α-淀粉酶活性變化趨勢基本一致，都隨著Cr（Ⅵ）處理濃度的升高呈先升后降趨勢，且活性都在 15 mg/L Cr（Ⅵ） 處理時達(dá)到最大值。與對照相比，Cr（Ⅵ）處理3 d 的小麥α-淀粉酶活性在Cr（Ⅵ）處理濃度為30 mg/L時受到抑制，處理濃度為3～25 mg/L均提高了α-淀粉酶活性；Cr（Ⅵ）處理7 d后，小麥幼苗的α-淀粉酶活性在25 mg/L時開始受到抑制，此后繼續(xù)升高Cr（Ⅵ）處理濃度，α-淀粉酶活性受到更強抑制。這與小麥胚芽生長的受抑制濃度略有差異，但與培養(yǎng)7 d的淀粉酶同工酶垂直電泳檢測結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，低濃度Cr（Ⅵ）處理對小麥種子的萌發(fā)有一定的促進作用，Cr（Ⅵ）濃度低于18 mg/L時，小麥胚芽的芽長以及淀粉酶同工酶活性與對照相比均有所提高；Cr（Ⅵ）濃度高于18 mg/L時，小麥苗芽與淀粉酶同工酶活性都受到了抑制，且隨著Cr（Ⅵ）濃度的升高，抑制作用更強。因此可以認(rèn)為，18 mg/L為臨界值，總體表現(xiàn)出“低促高抑”特點。這與李桂玲等在研究Cr3+處理對小麥種子幼苗的影響以及黃輝等研究Cr（Ⅵ）處理玉米幼苗中得到的結(jié)果一致[9-10]。此外，高濃度Cr（Ⅵ）處理時，小麥種子胚根生長的受抑制程度大于胚芽[11]，且對小麥同種器官在不同生長發(fā)育階段抑制作用不同，后期抑制程度更大。原因可能是種子胚根部位最先突破種皮暴露在Cr（Ⅵ）溶液中，隨著胚根受Cr（Ⅵ）脅迫時間延長，積累量越多，因此從宏觀上表現(xiàn)出受到更嚴(yán)重的傷害。

植物種子萌發(fā)需要足夠的物質(zhì)和能量來源，小麥等禾谷類植物種子的主要貯藏物質(zhì)是淀粉，通過淀粉酶水解淀粉獲得能源物質(zhì)進而完成種子的萌發(fā)，這個過程中淀粉酶活性至關(guān)重要[12-13]。本試驗結(jié)果表明，低濃度（3～15 mg/L） Cr（Ⅵ） 處理時，萌發(fā)7 d的小麥淀粉酶同工酶活性逐漸升高，使得淀粉的水解速度加快從而促進小麥種子胚芽的生長；當(dāng)Cr（Ⅵ）鹽濃度大于18 mg/L時，淀粉酶同工酶活性開始降低，相應(yīng)的小麥種子胚芽的生長受到了抑制，芽長均低于對照；高濃度Cr（Ⅵ）處理時，小麥α-淀粉酶活性也受到了不同程度的抑制，表現(xiàn)為小麥胚根胚芽的生長受到抑制。有學(xué)者研究了小麥和水稻種子萌發(fā)階段同工酶的表達(dá)，結(jié)果證明淀粉酶活性變化趨勢反映了實生苗的形態(tài)學(xué)變化[14-15]。因此，Cr（Ⅵ） 鹽對小麥種子萌發(fā)的影響可能是通過影響小麥種子中淀粉酶活性來實現(xiàn)的，但是關(guān)于Cr（Ⅵ）鹽如何作用于淀粉酶活性部位，以及高濃度Cr（Ⅵ）鹽如何引起淀粉酶活性下降等問題的分子機理值得進行進一步的研究。

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