胃癌腫瘤微環(huán)境中Th17細(xì)胞的分布及臨床意義△

蔣偉 王夫景 康悅#

1哈爾濱工程大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科，哈爾濱150001

2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外十科，哈爾濱150086

胃癌腫瘤微環(huán)境中Th17細(xì)胞的分布及臨床意義△

蔣偉1王夫景2康悅2#

1哈爾濱工程大學(xué)醫(yī)院內(nèi)科，哈爾濱150001

2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院普外十科，哈爾濱150086

目的探討隨著腫瘤的進(jìn)展胃癌腫瘤微環(huán)境中Th17細(xì)胞的分布及與患者預(yù)后、生存之間的關(guān)系。方法采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)60例胃癌患者Th17細(xì)胞在不同時(shí)期的胃癌腫瘤微環(huán)境中的陽(yáng)性表達(dá)率及分布。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色驗(yàn)證120例胃癌患者Th17細(xì)胞的表達(dá)情況，并分析Th17細(xì)胞的表達(dá)與患者預(yù)后生存之間的關(guān)系。結(jié)果60例新鮮胃癌組織標(biāo)本中，Th17細(xì)胞在腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率（10.3%±7.2%）高于癌旁正常胃組織（4.6%±2.5%），且組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而進(jìn)展期胃癌組織中Th17細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率（8.7%±6.8%）顯著低于早期胃癌組織（12.4%±7.6%），且組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。120例胃癌根治術(shù)后的組織標(biāo)本中，Th17細(xì)胞高表達(dá)組5年生存率為58.7%，低表達(dá)組為40.4%，二者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.634，P=0.031）。結(jié)論胃癌腫瘤微環(huán)境中Th17細(xì)胞的表達(dá)與疾病的進(jìn)展及患者的預(yù)后密切相關(guān)，可以作為預(yù)測(cè)胃癌患者術(shù)后生存的重要免疫指標(biāo)。

Th17細(xì)胞；微環(huán)境；預(yù)后；胃癌

Oncol Prog,2015,13(4)

胃癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，盡管早期檢測(cè)、手術(shù)切除和輔助化療在改善胃癌患者生存方面發(fā)揮了很大的作用，但大多數(shù)患者在就診時(shí)已進(jìn)入進(jìn)展期，其5年生存率僅約20%[1]。腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)和腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。隨著腫瘤免疫學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，從腫瘤免疫角度尋找胃癌腫瘤微環(huán)境中免疫調(diào)節(jié)的靶點(diǎn)，有希望成為胃癌治療的新手段和策略，對(duì)開(kāi)展胃癌的生物學(xué)治療具有重要意義。本研究主要是通過(guò)檢測(cè)Th17特征性標(biāo)志物的表達(dá)情況來(lái)反映這種T細(xì)胞亞群在胃癌腫瘤微環(huán)境中的變化，并分析Th17細(xì)胞的表達(dá)對(duì)患者預(yù)后的影響，為胃癌的免疫治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2012年7月至2013年10月間胃癌患者60例，對(duì)其腫瘤組織和癌旁正常胃組織（距離腫瘤組織5 cm以上）進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。其中男性35例，女性25例，年齡在26～72歲，中位年齡為58.2歲。采用《美國(guó)癌癥研究聯(lián)合會(huì)癌癥分期手冊(cè)》（第7版，2010）進(jìn)行TNM分期，其中早期胃癌（Ⅰ期）患者有25例，進(jìn)展期胃癌（Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期）患者有35例。腫瘤組織和癌旁正常胃組織標(biāo)本均在術(shù)中無(wú)菌條件下切取后立即進(jìn)行單個(gè)核細(xì)胞懸液的分離。

選取哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院2005年10月至2007年10月行根治性手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的胃癌患者120例，對(duì)其腫瘤組織和癌旁正常胃組織進(jìn)行免疫組化染色。其中男性有73例，女性有47例，年齡為22～78歲，中位年齡為57.6歲。

所有患者臨床病理資料完整，術(shù)前未經(jīng)過(guò)放療、化療或生物治療等抗腫瘤治療，術(shù)后有完整的隨訪記錄，排除自身免疫性及感染性疾病的患者。所有患者的死亡原因均為胃癌，生存時(shí)間為手術(shù)日至末次隨訪或死亡時(shí)間。

1.2 主要試劑

Anti-IL-17-PE購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；PMA、Ionomycin、BSA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Ficoll淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。兔抗人IL-17抗體、DAB顯示試劑盒購(gòu)于北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 流式細(xì)胞檢測(cè)

新鮮組織取材后，用機(jī)械的方法得到單個(gè)核細(xì)胞懸液。然后加入4m l Ficoll淋巴細(xì)胞分離液至15 m l離心管中，取4 m l組織懸液緩慢加入到Ficoll層上，以2000 r/m in離心20m in。吸取中間的單個(gè)核細(xì)胞層對(duì)單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并將其稀釋到所需濃度用于Th17/CD4+淋巴細(xì)胞檢測(cè)。加入抗IL-17-PE抗體后，上機(jī)進(jìn)行流式檢測(cè)。以CD4+IL-17+細(xì)胞代表Th17細(xì)胞，CD4+IL-17+/CD4+T細(xì)胞比例代表Th17細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

組織蠟塊進(jìn)行4μm厚的連續(xù)切片，石蠟切片常規(guī)脫蠟后進(jìn)行常規(guī)免疫組織化學(xué)染色（SP法），SP法染色時(shí)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。結(jié)果判定：CD4+IL-17+細(xì)胞染色以胞質(zhì)中的黃或棕色顆粒為陽(yáng)性。每張切片連續(xù)計(jì)數(shù)5個(gè)不同高倍視野，按著色強(qiáng)度和細(xì)胞陽(yáng)性率分別進(jìn)行計(jì)分：①按著色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；②按細(xì)胞陽(yáng)性率計(jì)分：≤10%為0分，11%～30%為1分，31%～50%為2分，51%～70%為3分，＞70%為4分；上述兩項(xiàng)的得分相乘得到評(píng)分。兩者乘積為0表示陰性（－），1～4為弱陽(yáng)性（+），5～8為陽(yáng)性（++），9～12為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）；（－）和（+）為低表達(dá)，（++）和（+++）為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示計(jì)量資料數(shù)據(jù)。各組間均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。CD4+IL-17+細(xì)胞的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，5年生存率的計(jì)算應(yīng)用Kaplan-Meier法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Th17細(xì)胞在胃癌腫瘤微環(huán)境中的分布

60例胃癌患者腫瘤組織和癌旁正常胃組織分別進(jìn)行腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）和胃黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（intra-epithelial lymphocytes，IEL）分離后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)TIL和IEL中CD4+IL-17+細(xì)胞的分布（圖1）。在腫瘤組織TIL中CD4+IL-17+細(xì)胞比例為（10.3%± 7.2%）（圖1A），而癌旁正常胃黏膜IEL中CD4+IL-17+細(xì)胞比例為（4.6%±2.5%）（圖1B），兩組間細(xì)胞比例的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在早期胃癌患者腫瘤組織TIL中CD4+IL-17+細(xì)胞比例（12.4%±7.6%）較癌旁正常胃黏膜IEL中明顯升高（5.1%±2.9%），且組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)展期胃癌患者腫瘤組織TIL中CD4+IL-17+細(xì)胞比例（8.7%±6.8%）亦高于癌旁正常胃黏膜內(nèi)IEL中的細(xì)胞比例（4.3%±2.1%），且組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果提示胃癌組織中CD4+IL-17+細(xì)胞更易在TIL中集聚，且在進(jìn)展期胃癌組織中的細(xì)胞比例（8.7%±6.8%）顯著低于其在早期胃癌組織中的細(xì)胞比例（12.4%±7.6%），組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而早期和進(jìn)展期胃癌的癌旁正常胃黏膜IEL中CD4+IL-17+細(xì)胞比例的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（5.1%±2.9%）vs（4.3%±2.1%），P＞0.05]。（圖2）

圖1 TIL和IEL中CD4+IL-17+細(xì)胞比例

圖2 CD4+IL-17+細(xì)胞在胃癌不同分期的腫瘤微環(huán)境中分布的比較

2.2 CD4+IL-17+細(xì)胞的表達(dá)情況和患者生存之間的關(guān)系

采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了120例患者的胃癌組織和癌旁正常胃組織中CD4+IL-17+細(xì)胞的原位表達(dá)。如圖3所示，CD4+IL-17+棕黃色陽(yáng)性顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)中。CD4+IL-17+細(xì)胞陽(yáng)性率在胃癌腫瘤組織中高于癌旁正常胃組織，二者之間有顯著性差異（χ2=8.213，P=0.004）。120例胃癌患者中，57例CD4+IL-17+細(xì)胞呈低表達(dá)，63例呈高表達(dá)。低表達(dá)組患者的5年生存率為40.4%，而高表達(dá)組的為58.7%，二者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 4.634，P=0.031）（圖4）。

圖3 CD4+IL-17+細(xì)胞在胃癌組織及癌旁正常胃組織中的表達(dá)（SP染色，×400）

圖4 CD4+IL-17+細(xì)胞的表達(dá)與胃癌患者生存的關(guān)系

3 討論

機(jī)體的免疫系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，既可以通過(guò)建立有利于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的腫瘤微環(huán)境來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，又能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖或破壞殺傷腫瘤細(xì)胞來(lái)控制腫瘤的生長(zhǎng)。Th17細(xì)胞是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種效應(yīng)CD4+T細(xì)胞亞群，可特征性分泌IL-17因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)血管形成和轉(zhuǎn)錄因子的激活[2]，參與多種自身免疫性疾病和癌癥的發(fā)生發(fā)展[3]，并且與患者的不良預(yù)后有關(guān)[4]。

Th17細(xì)胞在人類(lèi)腫瘤微環(huán)境中的分布已成為目前研究的熱點(diǎn)[5-6]，在前列腺癌、多發(fā)骨髓瘤、口腔癌、膀胱癌和卵巢癌的TIL中均可觀察到Th17細(xì)胞的集聚，并且大多數(shù)研究表明，其在腫瘤組織中的分布較高[7-8]。本研究結(jié)果表明，在胃癌TIL中CD4+IL-17+細(xì)胞比例為（10.3%±7.2%），癌旁正常胃黏膜TEL中CD4+IL-17+細(xì)胞比例為（4.6%±2.5%），胃癌組織中的細(xì)胞比例顯著高于癌旁正常胃組織，此結(jié)果與大多數(shù)文獻(xiàn)結(jié)果一致。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)隨著宮頸癌癌變的進(jìn)展，癌組織中Th17細(xì)胞的比例呈逐漸增高的趨勢(shì)，并且Th17細(xì)胞的比例與臨床分期、血管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。而Atarashi等[10]發(fā)現(xiàn)在進(jìn)展期卵巢癌TIL中IL-17+的表達(dá)較早期卵巢癌低，并且Th17細(xì)胞對(duì)進(jìn)展期卵巢癌患者的預(yù)后有積極作用。本研究中，我們對(duì)胃癌TIL中的Th17細(xì)胞進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在早期胃癌TIL中CD4+IL-17+細(xì)胞比例為（12.4%±7.6%），癌旁正常胃黏膜IEL中細(xì)胞比例為（5.1%±2.9%）；在進(jìn)展期胃癌TIL中CD4+IL-17+細(xì)胞比例為（8.7%±6.8%），癌旁正常胃黏膜IEL中的細(xì)胞比例為（4.3%±2.1%）。無(wú)論早期胃癌還是進(jìn)展期胃癌，CD4+IL-17+細(xì)胞在癌組織的表達(dá)均高于癌旁正常胃黏膜組織，早期胃癌組織的表達(dá)又明顯高于進(jìn)展期胃癌組織。提示胃癌組織中，Th17細(xì)胞在局部集聚可能發(fā)生于腫瘤的早期，隨著腫瘤的進(jìn)展，局部微環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致Th17細(xì)胞的分布發(fā)生改變，浸潤(rùn)的Th17細(xì)胞數(shù)量逐漸降低。但有研究表明，在鼠類(lèi)模型中，隨著腫瘤的進(jìn)展Th17細(xì)胞數(shù)量逐漸升高，隨后在腫瘤的進(jìn)展期達(dá)到最高水平[11]。這種研究結(jié)果的不同可能是由于鼠和人類(lèi)的腫瘤生物學(xué)行為的不同，在鼠類(lèi)腫瘤模型中種植的腫瘤生長(zhǎng)迅速而人類(lèi)腫瘤是逐漸進(jìn)展的并且生長(zhǎng)緩慢。

近年來(lái)，研究者對(duì)Th17細(xì)胞的表達(dá)與不同類(lèi)型腫瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，得出不同的結(jié)論。Tosolini等[12]對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境中Th17細(xì)胞的表達(dá)與患者預(yù)后進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示：腫瘤組織中CD4+IL-17+細(xì)胞的表達(dá)與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，CD4+IL-17+細(xì)胞對(duì)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用。相反，Kryczek等[13]在卵巢癌中的研究表明：在TIL中CD4+IL-17+細(xì)胞高表達(dá)的患者有較好的預(yù)后，并且生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。本研究對(duì)胃癌腫瘤微環(huán)境中CD4+IL-17+細(xì)胞的分析表明：在120例患者中，低表達(dá)組5年生存率為40.4%，而高表達(dá)組為58.7%；腫瘤微環(huán)境中CD4+IL-17+細(xì)胞高表達(dá)的患者預(yù)后較好，提示CD4+IL-17+細(xì)胞的表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后呈正相關(guān)。

綜上所述，Th17細(xì)胞在胃癌腫瘤微環(huán)境中的分布與疾病的進(jìn)展、患者的預(yù)后密切相關(guān)，有可能成為預(yù)測(cè)胃癌患者生存的重要免疫指標(biāo)。

［1］Jemal A,Siegel R,Xu J,et al.Cancer statistics,2010[J]. CA Cancer JClin,2010,60(5):277-300.

［2］Huang X,Lee C.Regulation of stromal proliferation, grow th arrest,differentiation and apoptosis in benign prostatic hyperplasia by TGF-beta[J].Front Biosci, 2003,8:s740-749.

［3］Ye J,Livergood RS,Peng G.The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity[J].Am J Pathol, 2013,182(1):10-20.

［4］Pelletier M,Maggi L,M icheletti A,et al.Evidence for a cross-talk between human neutrophils and Th17 cells[J]. Blood,2010,115(2):335-343.

［5］Zhang W,Hou F,Zhang Y,et al.Changes of Th17/Tc17 and Th17/Treg cells in endometrial carcinoma[J].Gynecol Oncol,2014,132(3):599-605.

［6］QiW,Huang X,Wang J.Correlation between Th17 cells and tumor m icroenvironment[J].Cell Immunol,2013, 285(1-2):18-22.

［7］Gaur P,Singh AK,Shukla NK,et al.Inter-relation of Th1,Th2,Th17 and Treg cytokines in oral cancer patients and their clinical significance[J].Hum Immunol, 2014,75(4):330-337.

［8］Chugh S,Anand V,Swaroop L,et al.Involvement of Th17 cells in patients of urothelial carcinoma of bladder [J].Hum Immunol,2013,74(10):1258-1262.

［9］Zhang Y,Ma D,Zhang Y,et al.The imbalance of Th17/ Treg in patients w ith uterine cervical cancer[J].Clin Chim Acta,2011,412(11-12):894-900.

［10］Atarashi K,Nishimura J,Shima T,et al.ATP drives lamina propria T(H)17 cell differentiation[J].Nature, 2008,455(7214):808-812.

［11］de Marzo AM,Nakai Y,Nelson WG.Inflammation,atrophy,and prostate carcinogenesis[J].Urol Oncol, 2007,25(5):398-400.

［12］Tosolini M,Kirilovsky A,M lecnik B,et al.Clinical impact of different classes of infiltrating T cytotoxic and helper cells(Th1,Th2,Treg,Th17)in patients w ith colorectal cancer[J].Cancer Res,2011,71(4):1263-1271.

［13］Kryczek I,Banerjee M,Cheng P,et al.Phenotype,distribution,generation,and functional and clinical relevance of Th17 cells in the human tumor environments [J].Blood,2009,114(6):1141-1149.

The distribution and clinicalsignificanceof Th17 cells in the tumor microenvironmentof gastric cancer

JIANGWei1WANG Fu-jing2KANG Yue2#1TheMedicalDepartment,the Hospitalof Harbin Engineering University,Harbin 150001,China
2The Tenth Departmentof GeneralSurgery,the Second A ffiliated Hospitalof Harbin MedicalUniversity,Harbin 150086,China

ObjectiveTo explore the distribution trends of Th17 cell in the tumor m icroenvironment as the gastric cancer progresses,and to investigate the correlation between Th17 cell and prognosis and survival of patients.MethodIn 60 cases of gastric cancer patients,the positive expression and distribution of Th17 cells in each tumor stage were detected by flow cytometry analysis(FACS).The expression of Th17 cells in 120 cases of gastric cancer patients were verified by immunohistochem istry(IHC).And the relationship between the expression of Th17 cells and the prognosis of gastric cancer patients were analyzed.ResultFresh tissue specimens of 60 gastric cancer patients were collected and analyzed,the positive expression of Th17 cells in tumor tissue was higher than that in the normal gastric tissue(10.3%±7.2%)vs(4.6%±2.5%),w ith statistically significant difference(P＜0.05).And the positive expression of Th17 cells in tissue w ith advanced disease was significantly decreased compared to that in those w ith early-stage disease(8.7%±6.8%)vs(12.4%±7.6%),(P＜0.05).In 120 post-gastrectomy tissue specimens,the 5-year survival rate was 58.7%in patients w ith high Th17 cell expression,and was 40.4%in those w ith low Th17 cell expression,and the difference was significant(χ2=4.634,P=0.031).ConclusionThe high expression of Th17 cell in the tumormicroenvironment was closely related w ith the progression of disease and the survival of the patients and may serve as an important and predictive immune indicator for survival.

Th17 cells;m icroenvironment;prognosis;gastric cancer

R735.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.04.11

黑龍江省自然科學(xué)基金（D201169）

#通信作者（corresponding author），e-mail：kangyue2002@126.com

2014-10-20）